獻血人群中HCV感染與HLA-II類基因的相關性研究

戴兵 徐罡 王芳 何吉 朱發明

獻血人群中HCV感染與HLA-II類基因的相關性研究

戴兵 徐罡 王芳 何吉 朱發明

目的 人類白細胞抗原（HLA）在機體抗病毒免疫中起重要作用，探討獻血人群中丙型肝炎病毒（HCV）感染與HLA-II類基因的相關性。方法 選擇2011年10月至2013年10月在浙江省血液中心獻血的人員中HCVRNA陽性的樣本45例，同時以健康人群為對照，其中HLA-DRB1位點對照樣本8 333例，HLA-DRB1位點對照樣本72例，用PCR-SBT方法測定獻血者HLA-II類基因中DRB1和DQB1等位基因情況。結果 HLA-DRB1基因的DRB1*01:02（P=0.0394，OR=23.4，95%CI=2.89～189.1），DRB1*13:01（P=0.0095，OR=5.60，95%CI：1.74～18.00）；HLA-DQB1基因的DQB1*03:03（P=0.0402，OR=0.45，95%CI：0.21～0.94），DQB1*06:01（P=0.0456，OR=2.47，95%CI：1.05～5.83），這些基因位點的多態性在HCVRNA陽性獻血者中的頻率與健康對照人群比較有統計學差異。結論 在獻血人群中HCV感染與HLA-II類基因中部分多態性位點有相關性。

獻血人群 HCV HLA-II類基因

人類白細胞抗原（HLA）基因定位于第6號染色體短臂21.3區域，全長為3 600kb，是目前所知最復雜的多態性遺傳系統，具有高度個體特性。HLA基因編碼的分子參與抗原的加工與遞呈、細胞間識別、抗病毒免疫調節、免疫殺傷等過程，具有重要的免疫功能。國外研究顯示[1-4]個體HLA基因型與HCV感染、病毒復制、對藥物反應等生物學過程存在一定的相關性。由于HLA基因呈現高度遺傳多態性，不同人群不同地區存在明顯的不同，而且HCV感染存在著很大的種族和地域上的差異，因此國外的研究數據并不一定適合我國人群。筆者對浙江獻血人群中HCV感染與HLA-II類基因相關性進行分析，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2011年10月至2013年10月在浙江省血液中心獻血的人員HCV RNA陽性樣本45例，并隨機選取HCV RNA陰性的健康體檢者作為正常對照組，其中HLA-DRB1對照組8 333例，HLA-DQB1對照組72例。獻血者的選擇按照《獻血者健康檢查標準》[5-6]。

1.2 試劑與儀器 美國Theremo electron corporation 的Forma classⅡA2生物安全柜；美國羅氏公司全自動核酸抽提系統MagNA Pure LC 2.0；美國Thermo Fisher Scientific公司 NanoDrop2000超微量分光光度計（ND2000）；美國ABI3730 DNA測序儀；ABI PCR擴增儀。抽提試劑：羅氏公司MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume（產品編號：03310515001）；擴增試劑：invitrogen Secore DRB1/DQB1Amp Swquencing kit；測序試劑：invitrogen Secore DRB1/DQB1 locus sequencing Kit。

1.3 基因組DNA的提取 吸取全血樣本100μl。使用MagNA LC 2.0全自動核酸分離純化系統，應用配套MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume自動抽提試劑盒，嚴格按儀器使用說明書操作。抽提后的DNA經超微量分光光度計檢測DNA濃度和純度，純度要求≥1.6，并用不含RNA酶的無菌水調整濃度至15～40ng/μl。

1.4 HLA-DRB1和DQB1基因片段的擴增及測序

1.4.1 HLA-DRB1和DQB1基因片段的擴增 擴增引物為試劑盒內置引物，試劑按試劑盒要求。熱循環條件為：預變性2步，95℃、10min，96℃、20s；PCR反應2步，36個循環：60℃、30s，72℃、3min。擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。

1.4.2 酶切反應 在每個反應孔中加入3μl ExoSAPIT，混勻離心后經過37℃，25min，80℃，15min的酶切反應后去除反應孔中多余的PCR引物和底物dNTPs，酶切后每孔加入2倍體積的無菌去離子水稀釋。

1.4.3 測序反應 在每個反應管/孔中分別加入8μl sequencing mix和2μl Exo SAP-IT處理過的PCR產物，離心混勻。運行熱循環程序：預變性：96℃、20s；PCR反應2步，25個循環，50℃、30s，60℃、2min。

1.4.4 測序反應產物純化 將測序產物用40μl乙醇沉淀，在每個測序反應孔中加入2μl NaAc/EDTA緩沖液。板震蕩2min，確保溶液混合均勻，離心3 000×g，30min后。將反應孔倒扣于面巾紙上離心500×g 1min，去除孔內液體。在每個測序反應孔中加入100μl 80%的乙醇溶液。離心3 000×g，5min。將反應孔倒扣于面巾紙上500×g離心1min，去除孔內液體，避光室溫干燥20min。

1.4.5 測序反應產物變性 在每個測序反應管中，加入15μl HiDi Formamide 0.3 mM EDTA水溶液，蓋白色貼膜，震蕩混勻，低速離心。置于PCR儀器上95℃變性2min，反應結束立刻置于冰上3min待溫度降下后，上毛細管測序儀進行序列測定。通過分析軟件對測序結果進行分析，確定HLA等位基因的位點。與本試劑盒相匹配的分析軟件是Assign SBT（Conexio Genomics，Western Australia）。

1.5 統計學處理 獻血者HCV RNA陽性人群與對照人群HLA頻率分析應用ARLEQUIN Ver 3.5軟件（http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3）。應用 Graphpad Prism5.0統計軟件，不同人群HLA基因頻率的比較采用χ2檢驗，獻血者HCV RNA陽性組與正常對照組HLA多態性危險因素暴露情況采用相對危險度（odd ratio，OR）。

2 結果

2.1 獻血者中HCV RNA陽性人群HLA-Ⅱ基因頻率分布情況 HCV RNA陽性獻血者樣本HLA-DRB1和HLA-DQB1基因頻率分布見表1～2。

表1 HLA-DQB1在HCV RNA陽性獻血中的分布頻率

表2 LA-DRB1在HCV RAN陽性獻血中的分布頻率

2.2 正常對照組HLA-Ⅱ基因頻率分布情況 正常對照組中HLA-DRB1和HLA-DQB1基因頻率分布數據分布見表3～4。

2.3 獻血者HCV RNA陽性組與正常對照組HLA基因頻率及特定位點多態性的分析 獻血者HCV RNA陽性組及正常對照組HLA等位基因頻率分布詳見表5～6。HLA-DRB1基因的 DRB1*01:02、DRB1*13:01，HLA-DQB1基因的DQB1*03:03、DQB1*06:01，這些基因位點的多態性在HCV確認感染獻血者與正常對照組比較有統計學差異。除HLA-DQB1*03:03為保護性基因外，上述多態性位點均為易感基因。

表3 正常對照組HLA-DRB1的分布頻率

表4 正常對照組HLA-DQB1的分布頻率

表5 獻血者HCV RNA陽性組與正常對照組HLA-DRB1的頻率分析

3 討論

HCV病毒感染并引發肝臟損傷的機制目前尚未完全明確，但有文獻報道宿主的HLA遺傳多態性與HCV感染、病毒的復制以及肝細胞損傷方面可能存在較大的作用。HLA基因編碼的分子參與抗原的加工與遞呈、細胞間識別、抗病毒免疫調節、免疫殺傷等過程，具有重要的免疫功能。Cangussu等[7]報道了巴西人中HLA-Ⅱ類等位基因DRB1*11和DQB1*03位點與慢性HCV感染的保護有關，它們可能通過選擇病毒表位遞呈給CD4+T細胞，從而影響抗病毒的免疫應答效應。Anuradha等[8]報道了印度西部人群中HLA-Ⅰ類等位基因A*03、A*32、B*15、B*55、CW*16、CW*18以及HLA-Ⅱ類等位基因DRB1*03、DQB1*03與HCV感染呈現相關性。上述研究顯示HLA基因型與HCV的感染存在一定的相關性，但是目前有關浙江人群HCV感染與個體HLA之間的關系尚缺乏相關的數據。

表6 獻血者HCV RNA陽性組與正常對照組HLA-DQB1的頻率分析

本實驗室采用PCR-SBT的方法分析了獻血者HCV RNA陽性及正常對照人群的HLA-Ⅱ類基因的頻率分布，發現HLA-DRB1基因的DRB1*01:02、DRB1*13: 01、HLA-DQB1基因的DQB1*03:03、DQB1*06:01基因頻率與正常對照人群比較有統計學差異（P＜0.05）。根據OR值情況發現在這些有統計學差異的HLA基因中屬于HCV易感基因的為HLA-DRB1*01:02、DRB1*13: 01、HLA-DQB1*06:01，保護性基因為HLA-DQB1*03: 03。既往研究結果中很多為低分辨數據，而本實驗室得到的HLA頻率數據均為高分辨數據，有一些數據存在差異，這些差異數據更能反應本地區特點，結合HCV生物學特點數據更有利于闡明HLA在獻血人群HCV感染中的免疫調節作用，對保障血液安全，探索HLA功能以及研究其與疾病的相關性提供基礎數據，具有重要的臨床意義。

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Association of HLA-II alleles with hepatitis C virus infection in blood donors

DAI Bing,XU Gang,WANG Fang,et al.Zhejiang Provincial Blood Center,Hangzhou 310052,China

Blood donors Hepatitis C Virus HLA-II alleles

2016-01-01）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省醫藥衛生項目（2016KYA070、2015KYB100）

310052 杭州，浙江省血液中心，衛生部血液安全研究重點實驗室，浙江省血液安全重點實驗室

朱發明，E-mail：zfm00@hotmail.com

【 Abstract】 Objective To investigate the association of HLA-II alleles with hepatitis C virus(HCV)infection in Zhejiang blood donors. Methods Forty five HCV positive cases were detected by blood nucleotide screening among blood donors in Zhejiang Provincial Blood Center from October 2011 to October 2013.HLA typing was performed with polymerase chain reaction analysis with sequence-based typing(PCR-SBT)in 45 HCVinfected blood donors;the healthy population was used for reference, including 8333 cases for HLA-DRB1 and 72 case for HLA-DQB1. Results The polymorphisms of HLA-II alleles DRB1*01:02 (OR=23.4,95%CI:2.89-189.1,P=0.0394),DRB1*13:01(OR=5.60,95%CI:1.74-18.00,P=0.0095),DQB1*03:03(OR=0.45,95%CI: 0.21-0.94,P=0.0402,),DQB1*06:01(OR=2.47,95%CI:1.05-5.83,P=0.0456)were significantly associated with HCV infection among blood donors. Conclusion Our data suggest that certain HLA-II alleles are associated with HCV infection as a host genetic factor among the Zhejiang blood donors.