攜Gelsolin單抗靶向超聲造影劑的制備及體外靶向實驗

秦顥誠，武 俊*，周 盟，張宇虹，宋 宇，李潔明，溫曉娜，唐建武，冉海濤

(1.大連醫科大學附屬第二醫院超聲科，遼寧 大連 116027；2.大連醫科大學病理教研室 遼寧省腫瘤轉移重點實驗室，遼寧 大連 116027；3.重慶醫科大學附屬第二醫院超聲科，重慶 400010)

攜Gelsolin單抗靶向超聲造影劑的制備及體外靶向實驗

秦顥誠1，武 俊1*，周 盟1，張宇虹1，宋 宇1，李潔明1，溫曉娜1，唐建武2，冉海濤3

(1.大連醫科大學附屬第二醫院超聲科，遼寧 大連 116027；2.大連醫科大學病理教研室 遼寧省腫瘤轉移重點實驗室，遼寧 大連 116027；3.重慶醫科大學附屬第二醫院超聲科，重慶 400010)

目的 制備一種以腫瘤淋巴轉移相關特異性膜抗原蛋白——凝溶膠蛋白(Gelsolin)為靶點的納米級高分子造影劑，并觀察其體外尋靶及顯影能力。方法 通過改良的雙乳化法制備高分子PLGA-COOH造影劑，以碳二亞胺法將造影劑與Gelsolin單抗連接，制備出GSN-PLGA靶向超聲造影劑。檢測該造影劑的一般性質，評估Gelsolin單抗與造影劑表面連接情況，評價其體外尋靶能力并進行體外顯影實驗。結果 GSN-PLGA靶向超聲造影劑平均粒徑為(575.67±4.71)nm，表面電位(-11.46±1.19)mV，造影劑表面GSN單抗結合率達96.93%。體外攝取實驗顯示細胞表面高表達Gelsolin抗體的小鼠腹水型肝癌高淋巴轉移細胞株(Hca-F細胞)可較多攝取GSN-PLGA靶向造影劑。體外顯像實驗顯示靶向超聲造影劑體外顯影效果較好。結論 GSN-PLGA靶向超聲造影劑可與高表達Gelsolin的Hca-F細胞特異性結合，且體外顯影效果較好。

超聲檢查；造影劑；靶向；聚乳酸羥基乙酸；凝溶膠蛋白

淋巴轉移是上皮來源惡性腫瘤早期轉移的主要方式，與腫瘤不良預后密切相關，早期發現和干預對延長患者生存期具有重要意義。目前常規影像學檢查主要通過腫瘤的形態學特征和血流灌注特征進行診斷，不能確切反映腫瘤的生物學行為，在腫瘤轉移的預警及早期識別中具有明顯的局限性。既往研究[1]報道，當小鼠肝癌淋巴轉移細胞株的轉移能力降低時，凝溶膠蛋白(Gelsolin)主要位于細胞漿和細胞骨架中，而當細胞株淋巴轉移能力增強時，其還出現在細胞膜上。高分子聚合物聚乳酸羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid， PLGA)具有較好的生物兼容性及生物可降解性，目前已廣泛應用于超聲造影劑微泡的制備[2]。本研究選用PLGA作為成膜材料，制備攜Gelsolin單抗的PLGA靶向高分子造影劑，并觀察其體外尋靶及顯影情況。

1 材料與方法

1.1非靶向超聲造影劑的制備 采用改良的雙乳化溶劑揮發法，精確稱取100 mg羥基端乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，聚合比50∶50)，充分溶解于 2 ml二氯甲烷中(連續相)，加入0.2 ml雙蒸水(分散相)，以VCY-500超聲波處理器(上海研永超聲設備有限公司)聲振(聲功率100 W，開4 s、關2 s，共120 s)獲得乳白色的一次乳化液，向其內加入5 ml的4%聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)溶液，繼續聲振(聲功率50 W，開4 s、關2 s，共90 s)獲得二次乳化液。而后加入20 ml的2%異丙醇溶液，于室溫下以85-2型恒溫磁力攪拌器(上海藍凱儀器儀表有限公司)攪拌2～4 h，使二氯甲烷充分揮發，待微泡表面固化，以雙蒸水反復離心洗滌(8 000轉/分)后收集微泡，加入少量甘露醇并分散于1 ml雙蒸水中，冷凍干燥24～48 h后充入氟碳氣體，即獲得PLGA非靶向超聲造影劑凍干粉。

1.2靶向超聲造影劑的制備 稱取10 mg PLGA非靶向超聲造影劑，分散溶解于適量pH=5.5的MES緩沖液(濃度0.1 mol/L)中，加入適量耦聯活化劑EDC/NHS(EDC/NHS最終濃度比為2∶5)，室溫振蕩孵育30 min，以雙蒸水反復離心洗滌(8 000轉/分)，去除未反應的EDC及NHS，再以pH=8.0的MES緩沖液(濃度0.1 mol/L)溶解活化的PLGA造影劑，加入40 μl濃度為200 μg/ml的Gelsolin單抗(終濃度為1.5 mmol/L)，室溫下振蕩孵育1～2 h，再以雙蒸水反復離心洗滌(8 000轉/分)，收集微泡，冷凍干燥24～48 h后充入氟碳氣體，即獲得GSN-PLGA靶向超聲造影劑凍干粉。

1.3靶向超聲造影劑性質檢測 稱取20 mg的GSN-PLGA靶向超聲造影劑凍干粉充分溶解于5 ml雙蒸水中，取少量涂于載玻片上。采用Olympus BX51-P型偏光顯微鏡觀察靶向造影劑的形態、分布。另取1 ml造影劑溶液，采用Malvern 3000 SSA激光粒徑儀檢測造影劑粒徑及Zeta電位。

1.4免疫熒光法檢測GSN-PLGA表面Gelsolin單抗的連接情況 稱取100 mg PLGA-COOH和少量DiI熒光染料充分溶解于2 ml二氯甲烷中(避光條件下)，獲得DiI標記的靶向PLGA造影劑及非靶向PLGA造影劑。分別稱取10 mg DiI標記GSN-PLGA靶向超聲造影劑及PLGA非靶向超聲造影劑凍干粉，并以5 ml雙蒸水充分溶解，各加入20 μl異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的羊抗小鼠IgG抗體，于4℃振蕩2 h，以雙蒸水反復離心洗滌 (8 000轉/分)后，于Zeiss LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡下對比觀察兩種造影劑抗體連接情況，并以Beckman Coulter CytoFLEX S流式細胞儀檢測抗體結合率。

1.5細胞培養 將小鼠腹水型肝癌高、低淋巴轉移細胞株(Hca-F、Hca-P，由大連醫科大學病理教研室提供)作為懸浮細胞，在含15%胎牛血清的1640完全培養液中于37℃、5% CO2、完全飽和濕度條件下培養，傳代培養2～3代。取對數生長期的Hca-F及Hca-P細胞，離心洗滌(8 000轉/分)后收集細胞，以1×106/孔的密度接種于6孔板內(共接種24個孔)，以不含胎牛血清的1640完全培養液饑餓培養4 h后保存備用。

1.6靶向超聲造影劑體外攝取實驗 將上述準備的細胞分為4組，每組各6個孔：Hca-F細胞非靶向PLGA組，各孔內加入150 μl香豆素-6標記的非靶向造影劑；Hca-F細胞抗體封閉組，先向各孔內加入20 μl Gelsolin單抗封閉細胞表面蛋白表達，20 min后向每孔內加入150 μl香豆素-6標記的靶向造影劑；Hca-P細胞GSN-PLGA組和Hca-F細胞GSN-PLGA組，各孔內均加入150 μl香豆素-6標記的靶向造影劑。細胞吞噬造影劑后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞質可發出綠色熒光。將6孔板移入孵箱內繼續孵育2 h，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)離心洗滌 (8 000轉/分)3次，每孔加入1 ml的4%多聚甲醛固定液固定15 min，再經PBS離心洗滌(8 000轉/分)3次，以20 μl DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚)進行細胞核染色，可將細胞核染成藍色，而后以PBS再次離心洗滌(8 000轉/分)后收集細胞。取適量細胞于LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國)下觀察各組細胞攝取造影劑情況。采用Beckman Coulter CytoFLEX S流式細胞儀測定Hca-F細胞及Hca-P細胞的熒光強度。

圖1 偏光顯微鏡下觀察，GSN-PLGA靶向超聲造影劑微泡大小均一，分散均勻(×600) 圖2 Malvern激光粒徑儀檢測GSN-PLGA靶向超聲造影劑粒徑為575.45 nm(A)，表面電位為-11.51 mV(B)

圖3 與二抗結合后GSN-PLGA靶向超聲造影劑熒光顯微鏡觀察(×400) A.DiI標記后的造影劑發出紅色熒光； B.FITC標記的二抗與造影劑結合后發出綠色熒光 圖4 流式細胞儀檢測單抗連接率 A.PLGA非靶向超聲造影劑； B.GSN-PLGA靶向超聲造影劑

1.7體外顯影實驗 稱取20 mg的GSN-PLGA靶向超聲造影劑凍干粉，以20 ml雙蒸水重懸稀釋,調整濃度至1 mg/ml、0.5 mg/ml和0.25 mg/ml，各取2 ml置于瓊脂糖凝膠孔內，另取2 ml脫氣水置于凝膠孔內作為對照。采用百盛MyLab Twice超聲診斷儀進行實時成像，線陣探頭，頻率5～12 MHz，機械指數0.06。

2 結果

2.1靶向高分子造影劑的一般性質 GSN-PLGA靶向超聲造影劑外觀為白色粉末狀，水溶性好，顯微鏡下觀察造影劑復溶后大小均一，形態規則，分散均勻(圖1)，平均粒徑為(575.67±4.71)nm(圖2A)，造影劑表面電位為(-11.46±1.19)mV(圖2B)。

2.2靶向造影劑表面Gelsolin單抗連接情況 DiI標記的GSN-PLGA靶向超聲造影劑表面Gelsolin一抗與FITC標記的羊抗小鼠二抗連接后，DiI發出紅色熒光(圖3A)，結合二抗的微泡發出綠色熒光(圖3B)。而DiI標記的非靶向PLGA超聲造影劑僅可見紅色熒光，未見綠色熒光。流式細胞儀測得PLGA非靶向超聲造影劑熒光抗體(單抗)結合率為0.73%(圖4A)，GSN-PLGA靶向超聲造影劑熒光抗體(單抗)結合率為96.93%(圖4B)。

2.3靶向超聲造影劑體外尋靶能力 Hca-F細胞非靶向PLGA組、Hca-F細胞抗體封閉組、Hca-P細胞GSN-PLGA組及Hca-F細胞GSN-PLGA組的平均熒光強度分別為(108.39±1.29)、(123.31±1.25)、(140.15±0.98)、(189.09±1.14)，總體差異有統計學意義(F=6741.287，P<0.001)。兩兩比較，Hca-F細胞GSN-PLGA組熒光強度高于其他3組(P均<0.05)；Hca-F細胞抗體封閉組及Hca-P細胞GSN-PLGA組的熒光強度均高于Hca-F細胞非靶向PLGA組，差異有統計學意義(P均<0.05)。體外攝取實驗激光共聚焦顯微鏡下表現見圖5，Hca-F細胞非靶向PLGA組及Hca-F細胞抗體封閉組細胞僅攝取極少量的造影劑，表現為微弱的綠色熒光。細胞表面高表達Gelsolin蛋白的Hca-F細胞可攝取更多GSN-PLGA靶向造影劑，其綠色熒光較細胞表面低表達Gelsolin蛋白的Hca-P細胞更強(圖5G、5I)，即該靶向造影劑針對Gelsolin靶點的靶向性較強。

圖5 激光共聚焦顯微鏡圖(×400) A～C.Hca-F細胞非靶向PLGA組； D～F.Hca-F細胞抗體封閉組； G～I.Hca-P細胞GSN-PLGA組； J～L.Hca-F細胞GSN-PLGA組 (圖A、D、G、J為細胞攝取造影劑后細胞質發出綠色熒光；圖B、E、H、K為經DAPI染色的細胞核發出藍色熒光；圖C、F、I、L為細胞質和細胞核合并圖像)

2.4體外顯影效果 GSN-PLGA靶向超聲造影劑體

圖6 不同濃度下GSN-PLGA靶向超聲造影劑及脫氣水體外顯影情況 A.1 mg/ml； B.0.5 mg/ml； C.0.25 mg/ml； D.脫氣水

外顯影效果見圖6，造影劑回聲均勻細膩，后方回聲無衰減，且隨造影劑濃度增加造影效果更優。

3 討論

超聲造影在腫瘤的診斷和鑒別診斷方面發揮著重要作用。但非靶向的超聲造影劑屬于血池顯像，不能透過血管內皮間隙滲透至腫瘤組織內，因此不能獲得腫瘤的特異性成像，在對良惡性腫瘤的鑒別方面具有局限性。研究[3]報道，腫瘤血管內皮間隙可允許直徑<700 nm的微粒穿過。因此，通過改進超聲造影劑的成膜材料，制備納米級超聲造影劑，使其直徑<700 nm，便可穿越腫瘤組織血管內皮間隙到達腫瘤靶區。如將納米級超聲造影劑與腫瘤相關抗原單克隆抗體或特異性配體連接，可在體內識別并結合腫瘤組織表面的特異性分子，實現造影劑在腫瘤組織中的主動靶向富集，從而提高超聲對腫瘤早期診斷的特異性。

自超聲造影劑問世以來，微泡成膜材料和填充氣體不斷改進，超聲造影劑的體積逐漸減小，顯影效果逐步提高。隨著近年高分子化學的快速發展，應用高分子材料與空氣或其他難溶性氣體制備出的微泡超聲造影劑具有微泡均勻度好，體內穩定性高，體內外存留時間長、抗壓力性能好，聲衰減微弱等特點[4-5]。PLGA是一種新型的成膜材料，具有生物兼容性及可降解性，用其制備的納米微泡不僅可包載化療藥物，還能夠與表面帶有氨基的單克隆抗體、配體、各種特異性短肽等活性物質通過共價鍵耦聯在一起，且性質穩定，是理想的超聲造影劑材料[6-8]，本實驗通過改良雙乳化法制備的納米級超聲造影劑微泡大小較均一，形態規則，分散均勻，體外顯影效果亦較好。

淋巴轉移是腫瘤致死的主要原因之一，及早診斷并及時治療有助于延長腫患者的生存期并提高生存質量。既往腫瘤超聲分子成像和靶向治療研究主要是針對腫瘤新生血管及腫瘤細胞的成像和抑制，目前血管外分子靶點的特異性成像已成為研究熱點。有研究[9]報道，Gelsolin是一種重要的骨架調節蛋白，在Ca2+依賴下調節細胞骨架actin的聚合和解聚，進而影響細胞的形態和運動，在細胞的黏附、侵襲和遷移過程中發揮重要作用。Gelsolin的高表達在部分腫瘤中可增加腫瘤細胞的運動能力，進而促進腫瘤的侵襲和轉移。在細胞偽足形成的頭端，Gelsolin能夠通過支架蛋白RACK1與整合素αvβ3結合并形成黏著斑，促進細胞局部的形變；在細胞遷移的尾端，Gelsolin能夠通過支架蛋白RACK1實現黏著斑的解聚，使細胞間的黏附性降低，從而促進細胞的遷移[10-11]。研究[12]報道，通過shRNA干擾下調Gelsolin在具高淋巴道轉移力的Hca-F細胞中的表達，不僅可明顯降低Hca-F細胞體外遷移和侵襲能力，還可降低體內淋巴結黏附能力，表明Gelsolin基因有促進淋巴道轉移的作用。Abbeele等[13]在對Hela、MDA-MB231和PC-3細胞的研究中也發現，干擾下調Gelsolin蛋白表達后腫瘤細胞的侵襲及遷移能力也隨之降低。本研究通過碳二亞胺法將Gelsolin單抗成功耦聯于PLGA納米微泡，制備攜Gelsolin單抗的高分子造影劑，此方法是利用PLGA-COOH中羧基與Gelsolin單抗中的氨基進行共價結合[14]，連接不易斷裂。本研究體外尋靶實驗結果表明GSN-PLGA靶向超聲造影劑可與細胞表面高表達Gelsolin的小鼠肝癌高淋巴轉移細胞進行特異性結合。

綜上所述，本研究制備的GSN-PLGA靶向超聲造影劑可與高表達Gelsolin的Hca-F細胞特異性結合，且體外顯影效果亦較好。相信該靶向超聲造影劑今后將有望為腫瘤淋巴轉移的分子顯像提供新的助力，從而進一步實現腫瘤淋巴道轉移的早期預警。

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Prepartation of Gelsolin-targeted ultrasound contrast agent and experiment in vitro

QINHaocheng1，WUJun1*，ZHOUMeng1，ZHANGYuhong1，SONGYu1,LIJieming1，WENXiaona1，TANGJianwu2，RANHaitao3

(1.DepartmentofUltrasound，theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China；2.DepartmentofPathology,DalianMedicalUniversity，KeyLaboratoryforTumorMetastasisofLiaoningProvince,Dalian116027,China; 3.DepartmentofUltrasound，theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400010，China)

Objective To prepare a kind of Gelsolin-targeted ultrasound contrast agent (GSN-PLGA) and to explore its targeting and imaging effection in vitro. Methods The high molecular PLGA-COOH ultrasound contrast agents were prepared by a modified double emulsion technique and then conjugated with Gelsolin monoclonal antibody by carbodiimide technique. The physical property of contrast agent was determined. And the connectivity condition of ultrasound contrast agent with Gelsolin monoclonal antibody was estimated. The targeting ability and the effect of enhancing ultrasound imaging in vitro were explored. Results The average diameter of GSN-PLGA was (575.67±4.71)nm. The potential was (-11.46±1.19) mV. And the binding rate of Gelsolin monoclonal antibody was 96.93%. In vitro experimentshowed more GSN-PLGA could be intaked by Hca-F cells and the ultrasound imaging cloud be enhanced greatly. Conclusion The GSN-PLGA nanoparticle can bind to Hca-F cells specifically and can enhance the ultrasound imaging greatly.

Ultrasonography； Contrast media； Target； Poly lactic-co-glycolic acid； Gelsolin

國家自然科學基金(81501476)、遼寧省自然科學基金(214023001)。

秦顥誠(1990—)，男，江蘇連云港人，在讀碩士。研究方向：腫瘤分子顯像與靶向治療。E-mail： 351518028@qq.com

武俊，大連醫科大學附屬第二醫院超聲科，116027。E-mail: wujun108@sina.com

2016-09-03

2017-02-25

R445.1; R-332

A

1003-3289(2017)06-0826-06

10.13929/j.1003-3289.201609013