熒光法測定葉綠素a的影響因素及其數據校正

張麗，郭翠蓮，張述偉，吳寧，王小紅，張天鵬，王昭玉

(山東省科學院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001)

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【海洋科技與裝備】

熒光法測定葉綠素a的影響因素及其數據校正

張麗，郭翠蓮，張述偉，吳寧，王小紅，張天鵬，王昭玉

(山東省科學院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001)

研究了濁度、溫度對葉綠素a現場熒光儀測定葉綠素a的影響。分別用可見光分光光度計和葉綠素a現場熒光儀測定了不同溫度、濁度梯度下小球藻水樣的葉綠素a濃度值，探究影響規律和修正方法。結果表明，溫度在7 ～ 30 ℃范圍內，對葉綠素現場熒光儀測定葉綠素a濃度無顯著影響；濁度在0 ～ 1 000 度范圍內，需用葉綠素a濃度實測值減去0.0174倍的濁度值(度)對測定值進行修正。

濁度；溫度；葉綠素a；熒光法

海洋中葉綠素a濃度及其時間變化可以反映水體中浮游植物的豐度及其變化規律，在一定程度上反映了水體中藻類數量和水質狀況，在研究浮游植物群落生物量、海洋生態環境特點、水生生態系統監測等方面起著重要的作用[1]，是水質環境監測的常規監測項目之一。

目前葉綠素a的測定方法有熒光法[2]、分光光度法[3]、高效液相色譜法[4]、遙感法等，其中熒光法因具有靈敏度高、簡單易操作、可現場實時測定等特點，已成為測定水體中葉綠素a的主要方法。應用熒光法基于葉綠素a的熒光誘導原理,研發葉綠素a現場熒光儀已成為國內外海洋監測研究的熱點之一[5-9]。葉綠素熒光儀具有小型化、攜帶方便、低功耗、集成化等優勢[10]，具有較好的應用前景。然而葉綠素a現場熒光儀檢測的環境是實際水體，自然水體環境較復雜，測量結果不可避免地會受到環境因素的影響，其中溫度和濁度是最主要的影響因素。

本文通過實驗分析溫度和濁度對現場熒光法測定葉綠素a的影響規律，確定了影響范圍，從而對現場測定的數值進行修正，使實驗數據更具可靠性，為葉綠素a現場熒光法測定的應用提供了參考依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

YSI 6600型多參數水質監測系統(美國YSI公司)；可見光分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。無濁度海水：取自石老人海水浴場，通過0.45 μm濾膜制備；無藻懸濁液由海水沉積物制備，海水沉積物采自山東青島潮連島外海；丙酮為國產分析純；試驗用海水小球藻由國家海洋局第一海洋研究所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 無藻懸濁液的制備及濁度的測定

參照張武等[11]的研究結果，葉綠素在高溫下能夠降解，將采集的沉積物濕樣于坩堝中105 ℃灼燒60 min[3],灼燒后的沉積物經過研磨、過150目孔篩，按照0 ～ 1 000 度濁度梯度加入到過濾海水中，攪拌均勻制成無藻懸濁液。濁度采用YSI 6600型多參數水質監測系統測定。

1.2 樣品葉綠素a的測定

1.2.1 分光光度法

將不同濃度葉綠素含量的藻液懸濁液以丙酮溶液(體積分數90% )提取浮游植物色素后，依次在630、647、664、750 nm波長下測定吸光度，并以90%丙酮作為校正空白，測定葉綠素a的含量[12]。計算公式為:

式中：ρa為樣品中葉綠素a的質量濃度，μg/L；v為樣品提取液體積，mL；V為樣品實際用量，L；L為測定池光程，cm。

1.2.2 YSI 6600型多參數水質監測系統

檢查儀器連接，連好后開機，并打開軟件。將YSI葉綠素傳感器探頭置于不同濃度葉綠素含量的藻液懸濁液樣品中，待示數穩定后讀取測量結果。

1.3 濁度對葉綠素a現場熒光儀測定結果的影響

取不同體積的海洋小球藻母液，用過濾海水定容至一定體積，將葉綠素a現場熒光儀置于樣品中，按照一定濃度梯度(0 ～ 1 000度)加入沉積物樣品，用磁力攪拌器攪拌均勻，待葉綠素a現場熒光儀的示數穩定，連續讀數2 min，同時測定其濁度，取平均值。分別測試分析濁度對2.1、11.70、20.2 μg/L葉綠素a濃度的海水小球藻懸濁液的影響。

1.4 溫度對葉綠素a現場熒光儀測定的影響

以葉綠素a濃度為 3.5 μg/L的小球藻懸浮液作為測試樣品，將樣品和YSI 6600型多參數水質監測系統同時冰浴、水浴，根據實際水體的溫度變化范圍，使溫度變化在7 ～ 30 ℃之間，記錄溫度和葉綠素a測定值，分析溫度對葉綠素a現場熒光法測定結果的影響。

2 結果與討論

2.1 濁度對葉綠素a現場熒光儀測定結果的影響

在不同濁度的影響下，葉綠素a測定結果見圖1。

圖1 濁度對測定不同葉綠素a濃度小球藻樣品的影響曲線Fig.1 The influence of turbidity on determination of different chlorophyll a concentration of Chlorella vulgaris

由圖1可知，濁度在0 ～ 1 000 度范圍內，相同濃度的葉綠素a樣品隨著濁度的升高測定值呈上升趨勢，且葉綠素值和濁度呈顯著的正相關(p<0.05)。兩者符合線性回歸方程 y = kx。其中x為樣品的濁度；y為濁度影響下葉綠素a測量值；k為線性斜率。實驗設置3個葉綠素濃度(2.1、11.70、20.2μg/L)的小球藻底值，結果表明受濁度影響的程度均一致，k分別為 0.017 3、0.017 6、0.017 2，線性相關系數r為 0.988～0.996。以均值0.017 4為系數估算葉綠素a改變量，修正后的值與原測值的相對誤差在0.3% ～ 12%之間，遠小于未修正的葉綠素a測定值與真值的相對誤差4% ～ 758%。

所以，使用葉綠素a現場熒光儀測定葉綠素值時，當水體濁度在0 ～ 1 000 度范圍內，可以用以下公式修正測定值：

水體中葉綠素a濃度估值(μg/L) = 葉綠素a濃度實測值 - 0.017 4×水體濁度 。

以10%的相對誤差為限，當水體濁度(度) / 葉綠素a濃度實測值小于等于5.2時，葉綠素a現場熒光儀測定值與估值之間的偏差較小，即此時濁度對葉綠素a測定結果無顯著影響，可以不作修正；當水體濁度(度) / 葉綠素a濃度實測值比值大于5.2時，濁度對測定結果有顯著的影響，需要通過上述公式修正后，數據方能接近估值。

實驗結果與趙洋甬等[3]、呂鵬翼等[13]在研究濁度對熒光法測定葉綠素a的影響時得出的結論基本一致，即濁度能夠引起水體中葉綠素a含量測定值的增加，且增加量與濁度呈正相關。這是由于水體中含有大量懸浮物或顆粒物，會對激發光和產生的熒光發生強烈的反射和散射作用，提高了測定的本底值，從而造成測定結果偏高。對比本實驗與前者實驗結果表明，葉綠素a現場熒光儀測定值受濁度的影響程度有所不同，主要可能是不同實驗儀器性能不同，儀器實驗時受環境因素影響不同造成的。

2.2 溫度對葉綠素a現場熒光儀測定結果的影響

溫度對葉綠素a現場熒光儀影響的測定結果原始數據見表1，處理數據并用Origin9.0作圖，見圖2。

表1 不同溫度下葉綠素a測定值

圖2 葉綠素a濃度測定值與溫度關系曲線Fig.2 The curve of the measured value of chlorophyll a with temperature

圖2是按照1.4中實驗步驟得出的結果,由圖可以看出,在7 ～ 30 ℃溫度范圍內，海水葉綠素現場熒光儀測定的葉綠素a濃度值與溫度無顯著的線性關系。樣品葉綠素a濃度值為3.5μg/L，通過數據分析得出在7 ～ 30 ℃溫度范圍內，測定值與真值的相對誤差在-8.6%～11.4%之間，在儀器測量誤差的可接受范圍內。

一般情況下，溶液的熒光強度隨著溫度的降低而增強，在一定范圍內，熒光強度的減弱與溫度的升高呈線性關系。主要是因為溫度升高會使溶液的粘度降低，熒光分子和其他分子之間的碰撞幾率會增加，造成了熒光猝滅，導致熒光光強度降低[10]。劉建華[10]在研究海水葉綠素現場檢測儀溫度實驗時發現葉綠素a(92.32μg/L)的熒光強度隨溫度(13 ～ 36 ℃)升高而下降，而本實驗未發現此規律，可能是因為本實驗使用的海水葉綠素現場熒光儀已對測定值進行校正。

3 結論

在7 ～ 30 ℃范圍內，海水葉綠素現場熒光儀測定的葉綠素a濃度值與溫度無顯著的線性關系。在試驗所設濁度范圍內(0～1 000度)，使用海水葉綠素a現場熒光儀測定葉綠素a濃度(2.1、11.70、20.2L)時，葉綠素a測定值與濁度呈顯著的正相關；當(水體濁度(度)/葉綠素a濃度)實測值不高于5.2時，濁度對葉綠素a測定結果無顯著的影響；當(水體濁度(度)/葉綠素a濃度)實測值大于5.2時，濁度對葉綠素a測定結果有顯著的影響，可用(葉綠素a濃度測定值-0.017 4×水體濁度(度))進行修正，得到與水體中實際葉綠素a濃度較為接近的估計值。

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The influence factors of fluorescence determination of chlorophyll a and the data correction for them

ZHANG Li,GUO Cui-lian, ZHANG Shu-wei, WU Ning, WANG Xiao-hong, ZHANG Tian-peng, WANG Zhao-yu

(Institute of Oceanographic Instrumentation, Shandong Academy of Sciences, Qingdao 266001, China)

∶ The impacts of turbidity and temperature on the determination of chlorophyll a in the sea water with field fluorescence method were studied in this paper. The chlorophyll a concentration ofChlorellavulgarisat different temperature and turbidity gradients was determined by visible spectrophotometer and the field fluorescence respectively, to explore the influence rule and the method for correction. Results reveal that temperature has no significant effects on the concentration of chlorophyll a in the range of 7 ～ 30 ℃, while turbidity has significant influence on the determination of chlorophyll a in the range of 0 ～ 1 000 NTU, which should be modified by the following method: The true value equals to measured value minus 0.017 4 times’ turbidity value (NTU).

∶turbidity; temperature; chlorophyll a; fluorescence

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.03.002

2016-11-22

海洋公益性行業科研專項經費項目(201505007)；山東省科學院青年基金(2014QN039)；山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金(BS2014HZ015)

張麗(1988—)，女，研究實習員，研究方向為海洋環境監測。E-mail: zhang1222li@163.com

P714

A

1002-4026(2017)03-0008-04