綠豆SSR—PCR反應體系的建立與優化

趙雅楠++王穎++張東杰

摘要：為探究影響綠豆SSR-PCR反應的因素，建立綠豆SSR-PCR最佳反應體系，為綠豆遺傳多樣性分析、品種鑒定等提供參考。采用正交設計與單因素試驗聯合分析法，從Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs及模板DNA 5個因素對綠豆SSR-PCR反應體系進行優化分析。5個因素中，Mg2+對SSR-PCR結果影響最大。SSR-PCR反應最佳體系為 20 μL 體系中含0.8 mmol/L Mg2+、1.25 U Taq酶、1.4 μmol/L引物、1.8 mmol/L dNTPs、25 ng模板DNA。該綠豆 SSR-PCR反應體系的建立為進一步利用SSR分子標記技術研究綠豆資源奠定了基礎。

關鍵詞：綠豆；SSR-PCR；正交設計；單因素試驗；分子標記技術

中圖分類號： S643.401文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0023-03

綠豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek]是豇豆屬（Vigna）亞洲豇豆亞屬（Ceratotropis）的主要栽培豆種，是我國的原產作物，有2 000多年的栽培歷史，目前的主產區集中在內蒙古、吉林、黑龍江等地，種植面積和產量均居世界前列。綠豆種子富含淀粉、蛋白質、膳食纖維、礦物質及維生素等營養素和低聚糖、黃酮等功能成分[1]，同時還是傳統的藥食同源食材，可清毒解暑、降血糖、抗腫瘤等，被譽為糧食中的“綠色珍珠”“濟世糧谷”。然而在長期種植過程中，由于綠豆優良親本材料的頻繁交流，導致品種退化、遺傳變異水平降低、新品育種緩慢，使綠豆在國內外市場的發展面臨嚴峻考驗[2]。

近些年，DNA分子標記技術不斷發展，為作物育種、遺傳多樣性分析、種子純度鑒定等提供了新途徑。簡單重復序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）是廣泛分布于植物基因組中的以1～6個串聯核苷酸為重復單位的DNA序列，作為第二代分子標記技術的典型代表，SSR因多態性豐富、重復性好、標記共顯性等特點[3]，在大豆、玉米、水稻等作物的遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、QTL定位等研究中應用廣泛[4-6]，而目前國內基于SSR技術對綠豆的研究較少，與一些大宗作物相比，綠豆基因組研究還處于落后階段，特別是針對綠豆SSR-PCR體系建立及優化的研究鮮有報道。本研究利用正交設計與單因素試驗聯合分析法對影響綠豆SSR-PCR反應體系的5個因素（Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs、模板DNA）進行優化，旨在為綠豆SSR標記研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

以綠豆C0633為試材，試材模板DNA由北京市農林科學院作物研究所提供。以來源于NCBI的引物VJ31122B（正向：5′-TCACAAAGGGAGGGAAGAGA-3′；反向：5′-CCCCAGGTTGGTTGGTTGGA-3′）為目標引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。植物基因組DNA提取試劑盒、Mg2+、10×buffer、dNTPs、Taq DNA聚合酶等均購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1綠豆基因組DNA提取以新鮮綠豆嫩葉為材料，利用Plant Genomic DNA Kit提取綠豆基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量，利用TBD-3000核酸蛋白檢測儀分析DNA純度與濃度，以確定是否滿足后續試驗要求，檢測合格后稀釋成30 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2正交設計優化采用L16（45）正交設計對Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs及模板DNA進行優化。總體系為20 μL，除上述變化因素外，每組體系還含有2 μL 10×PCR buffer，其他用ddH2O補齊，每個處理重復2次（表1、表2）。

1.2.3單因素試驗設計在正交設計優化的基礎上，對影響SSR-PCR反應體系的部分因素進行單因素分析，進一步優化SSR-PCR體系。每個因素設置8個水平，每個梯度處理重復2次（表3），總體系中包含2 μL 10×PCR buffer，其他影響因素濃度參照正交設計中的最優組合條件，用ddH2O補齊至20 μL。

1.2.4SSR-PCR擴增及檢測PCR反應在東勝龍ETC-811 PCR儀上進行，參數為94 ℃預變性5 min，40個循環（94 ℃ 變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸

8 min，4 ℃下保存。以Low MW DNA Marker-A作對照，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，在紫外凝膠成像系統下觀察拍照。

2結果與分析

2.1正交試驗結果分析

由圖1可知，16個處理因Mg2+、Taq酶、引物、dNTPs及模板DNA濃度的不同而導致擴增效果存在明顯差異。其中第4組處理未擴增出條帶，11、12、13組條帶較弱，第3、6、10組處理效果較好，條帶清晰、明亮，未出現明顯拖尾、彌散現象。參照賀石林的統計方法[7]，對2次正交試驗結果進行獨立打分統計，根據條帶強弱、背景清晰程度等進行評價，最優處理得16分，最差處理得1分，各體系得分分別為9、11，10、10，9、7，1、1，9、10，15、16，10、8，9、9，3、2，16、15，4、3，2、2，4、3，7、7，9、8，7、11。根據2次評分求出各因素不同水平評分之和T、平均分K以及極差R。在假設不考慮各因素間交互作用的情況下，R值越大，表示該因素對反應體系的影響越大，K越大，則表示反應水平越好[8]。由表4可知，5個因素對 SSR-PCR 反應影響順序依次為Mg2+>Taq酶>dNTPs>引物>DNA模板。

2.2單因素試驗設計優化綠豆SSR-PCR體系

2.2.1Mg2+對SSR-PCR反應的影響Mg2+是影響SSR-PCR反應的重要因素之一，通過調控Taq酶活性影響PCR反應結果[9]。由圖2可知，單因素優化試驗設置的Mg2+濃度梯度范圍內均能擴增出條帶，但清晰度、特異性及背景顏色存在差異。Mg2+濃度在0.1～0.5 mmol/L時，擴增條帶較弱、辨識度較低；濃度為0.8～1.0 mmol/L時，擴增條帶清晰、明亮；當濃度大于1.0 mmol/L時，擴增產物量減少，條帶現彌散狀。故最佳反應體系中的Mg2+濃度確定為0.8 mmol/L，與正交優化試驗結果一致。

2.2.2Taq酶對SSR-PCR反應的影響由圖3可知，在一定范圍內，隨著Taq酶用量的增加，擴增條帶逐漸清晰，但達

到一定濃度后，Taq酶用量即成為擴增效果的負相關因素。Taq酶濃度為0.5 U/20 μL時，未擴增出條帶；濃度為0.75～1.00 U/20 μL時，擴增條帶較弱且穩定性較差，結果不可靠；當Taq酶濃度為1.25 U/20 μL時，條帶清晰、重復性好；而當濃度大于1.25 U/20 μL時，非特異性擴增條帶增多，并出現引物二聚體。綜合上述分析，最佳反應體系中Taq酶用量為1.25 U/20 μL，與正交優化試驗結果相比，Taq酶濃度在最佳組合10與最佳水平之間。

2.2.3dNTPs對SSR-PCR的影響dNTPs是SSR-PCR反應的重要底物，由圖4可知，當dNTPs濃度為0.2～0.8 mmol/L，條帶較暗且有引物二聚體出現；當濃度為1.2、1.5 mmol/L時，引物二聚體消失，條帶逐漸明亮清晰；當濃度達到1.8 mmol/L時，擴增效果最佳。隨著dNTPs濃度繼續增加，擴增效果差異不大，因此，從節約材料角度考慮，選擇 1.8 mmol/L 為dNTPs的最佳反應濃度。

3討論

SSR是以PCR反應為基礎的分子標記技術，分析結果受PCR擴增效果影響，而PCR反應的擴增情況受諸多因素控制，且不同作物對PCR反應的敏感程度及要求也各不相同，因此建立和優化SSR-PCR反應體系是十分必要的。本研究采用正交設計與單因素試驗綜合分析法，對影響綠豆SSR-PCR反應體系的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物及模板DNA進行優化，該法充分利用了正交設計的整齊可比性、均衡分散性、可伸縮及效應明確的優點，既解決了單因素設計得到的各因素最優水平不一定是最佳組合的矛盾，又避免了試驗量大、周期長等問題，使SSR-PCR的建立和優化更加有效、嚴謹。但須指出，對正交優化結果進行直觀分析存在一定主觀成分，因此在接下來的研究中應增加重復試驗次數，多次評判以減少打分誤差，也可以借助軟件對結果進行分析。同時本研究在正交試驗中的Mg2+濃度、酶含量、dNTPs濃度都在單因素優化試驗的最佳范圍內，但結果并不完全吻合，這可能是因為正交試驗設置的水平梯度間隔較大，也可能是各因素之間存在一定的交互作用，試驗得到的最佳濃度不同。此外，從試驗結果還可以看出，SSR-PCR反應體系中對因素濃度的要求并不十分精確，即在一定范圍內均可得到清晰、穩定的條帶。結合考慮擴增效果及節約原料等因素，最終得到的最佳體系為（20 μL）：0.8 mmol/L Mg2+、1.25 U Taq酶、1.4 μmol/L引物、1.8 mmol/L dNTPs、25 ng模板DNA。

根據方差分析可知，Mg2+對SSR-PCR反應體系影響最大，其次是Taq酶，然后依次是dNTPs、引物，模板DNA對體系影響最小。Mg2+是Taq DNA聚合酶的輔助因子，能夠影響酶活性，同時還會與dNTPs產生拮抗作用[10]，對PCR擴增效果的影響主要表現在PCR擴增產物的特異性及產量方面。Taq酶是Mg2+的依賴性酶，濃度過低會導致活性不夠，PCR反應不充分，擴增產物產量少，濃度過高不僅會浪費原料，還會降低PCR反應的特異性，導致擴增條帶難以辨識[11]。dNTPs是PCR反應的重要原料，濃度過高會增加非特異性擴增，濃度過低則可能消耗過快，造成單鏈化，最終導致擴增失敗。引物與模板結合的特異性及穩定性直接影響PCR擴增產率。引物濃度過低，會降低產物產量，濃度過高則會與模板DNA結合形成二聚體，造成背景彌散、顏色加深[12]。同時，本研究發現模板DNA對SSR-PCR反應的影響最小，這可能與SSR標記的特點有關，即少量模板即可滿足反應的需求，

對濃度和數量要求不嚴。另外，有學者指出，任何形式的DNA和RNA都能夠滿足作為底物的要求，在大多數的PCR過程中，對DNA模板濃度要求很寬泛，在某適宜濃度范圍內即可，本研究結果與其基本吻合。

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