花生膜聯(lián)蛋白基因AhAnn1的克隆與表達(dá)分析

丁 紅，戴良香，秦斐斐，慈敦偉，宋文武，張智猛

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生膜聯(lián)蛋白基因AhAnn1的克隆與表達(dá)分析

丁 紅，戴良香，秦斐斐，慈敦偉，宋文武，張智猛

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

為挖掘花生抗逆境脅迫相關(guān)基因，克隆抗逆相關(guān)膜聯(lián)蛋白Annexin基因，以花生品種花育25號為試驗材料，從已知抑制消減雜交文庫中獲得花生膜聯(lián)蛋白Annexin類似基因片段，通過RACE技術(shù)獲得Annexin基因5′-RACE片段。對5′-RACE序列和抑制消減雜交文庫中已知基因片段進(jìn)行拼接，設(shè)計特異引物通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增得到該基因，命名為AhAnn1。結(jié)果表明，AhAnn1全長為1 277 bp，開放閱讀框為951 bp。根據(jù)編碼區(qū)預(yù)測AhAnn1編碼一條316個氨基酸組成的多肽，預(yù)測分子量為36.10 kDa，等電點為7.07。預(yù)測該基因編碼的蛋白含有膜聯(lián)蛋白Annexin保守結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞質(zhì)中。蛋白序列多重比對和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，花生與大豆、苜蓿、鷹嘴豆等豆科植物中的膜聯(lián)蛋白相似性最高，親緣關(guān)系最近。熒光實時定量PCR結(jié)果顯示，AhAnn1在根系和葉片中的表達(dá)量隨干旱脅迫程度的增加而增加。由此推測AhAnn1是一種干旱脅迫應(yīng)答基因，在花生逆境調(diào)控中發(fā)揮作用。結(jié)果為進(jìn)一步研究花生AhAnn1基因的功能和花生抗逆境脅迫相關(guān)分子機理提供了理論基礎(chǔ)。

花生；膜聯(lián)蛋白基因；干旱；系統(tǒng)發(fā)育分析；熒光定量PCR

膜聯(lián)蛋白(Annexins，Ann)是依賴鈣離子與磷脂膜可逆結(jié)合的一種可溶性保守蛋白家族。Annexin蛋白在動植物及菌類等生物體內(nèi)普遍存在，在各器官中幾乎均有表達(dá)[1-2]。研究表明，植物膜聯(lián)蛋白參與建成膜結(jié)構(gòu)、生成細(xì)胞壁、響應(yīng)逆境脅迫、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號、膜泡運輸及調(diào)控果實成熟等生理過程，對細(xì)胞生長、發(fā)育、分化及再生修復(fù)具有重要作用。目前已從大豆[3]、擬南芥[4]、玉米[5]、木薯[6]、黃瓜[7]及水稻[8]等植物中分離得到Annexin基因。植物Annexin與逆境脅迫的關(guān)系已有較多的報道，植物受到干旱、鹽堿、低溫及氧化脅迫等逆境時，Annexin蛋白表達(dá)能增加其對逆境的耐受力[9-14]。擬南芥AtANN1缺失突變株抗旱能力降低而過表達(dá)植株耐旱性明顯提高，且該基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量顯著上升[13]。低溫脅迫能夠上調(diào)水稻中膜聯(lián)蛋白的表達(dá)[11]。將芥菜AnnBj1基因轉(zhuǎn)入煙草幼苗后可增強煙草幼苗對非生物脅迫和生物脅迫的抵抗能力[15]。

花生是重要的油料作物和經(jīng)濟作物，干旱、鹽堿等逆境對其產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大。Annexin在植物逆境脅迫應(yīng)答中具有重要作用，但目前膜聯(lián)蛋白Annexin在花生抗逆機制中的研究報道較少，其在花生抗逆境脅迫中所起的作用不甚明確。本研究克隆得到花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1基因，對其序列和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，并對不同干旱脅迫程度下AhAnn1基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

以花生品種花育25號為試驗材料，在光照16 h/8 h黑暗(28 ℃/22 ℃)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行盆栽試驗。在培養(yǎng)盆內(nèi)裝土后澆水使其土壤含水量達(dá)飽和含水量，待濕度降低至田間持水量時進(jìn)行播種，播種后25 d進(jìn)行不同干旱脅迫處理。水分處理按Hsiao[16]和黎裕[17]的標(biāo)準(zhǔn)劃分：設(shè)置正常供水處理：75%FC(Filed capacity，田間持水量)；干旱脅迫分別設(shè)置中度干旱脅迫45%FC和重度干旱脅迫20%FC，脅迫時間為5 d。

1.2 試驗試劑

總RNA 提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。RACE(Rapid amplification of cDNA ends)試劑盒和50 BD Advantage 2 polymerase mix購自Clontech公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司。pMD18-T載體、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 提取RNA與反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

樣品總RNA提取使用RNeasy Mini Kit，總RNA中殘留基因組DNA用DNase Ⅰ酶處理去除。紫外分光光度法測定提取的RNA在260，280，230 nm處的吸光度值，確定RNA的濃度及純度。按照1 OD=40 μg RNA計算RNA產(chǎn)率。OD260/280為1.8～2.0時視為RNA的純度很高。吸取2 μg總RNA樣品利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系為20 μL。

1.4 5′-RACE片段和基因全長的獲得

通過序列比對分析從構(gòu)建得到的抑制消減雜交文庫中獲得花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1類似基因片段。序列分析結(jié)果表明，該已知序列缺少5′端序列，利用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)試劑盒擴增其5′端序列。根據(jù)已經(jīng)獲得Ann1類似基因片段序列設(shè)計5′-RACE反應(yīng)特異性引物為：5′-CTCGTAGCCACCACTCTTGT-3′。對獲得5′端片段進(jìn)行測序分析后與已知基因片段拼接得到花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1基因的全長。根據(jù)拼接結(jié)果找到基因的起始密碼子和終止密碼子，從兩端設(shè)計特異性引物5′-ATGTCGACTCTGAGAATTCCTC-3′和5′-TCAAACATCATCATGTCCTAA-3′。利用50 BD Advantage 2 polymerase mix高保真DNA聚合酶通過PCR擴增得到花生中Ann1基因的開放閱讀框。

1.5 序列分析

利用Blast工具(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對花生AhAnn1基因與其他基因的相似性進(jìn)行查找，開放閱讀框利用ORF finder(Open reading frame finder)在線進(jìn)行分析。AhAnn1基因編碼的氨基酸序列由所獲得基因的cDNA序列推導(dǎo)得到，并利用下述軟件對氨基酸序列進(jìn)行分析：蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)采用Protparam(http：//web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行預(yù)測；亞細(xì)胞定位利用LOCtree3 (https：//rostlab.org/services/loctree3)進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析通過TMHMM軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行；蛋白的保守結(jié)構(gòu)域利用NCBI的CDSS(Conserved Domain Search Service)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAMan軟件的多重序列比對(Multiple alignment)對不同植物的膜聯(lián)蛋白進(jìn)行多重序列比對分析；利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化分析，采用鄰接法NJ(Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 熒光定量RT-PCR

采用Roche的LightCycler 2.0熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR，以Actin11為內(nèi)參基因[18]，3次重復(fù)，采用2-ΔΔct方法分析數(shù)據(jù)。熒光定量PCR所用AhAnn1引物為5′-TTTGTGGCAGCGGTTATTATGT

C-3′和5′-ATCCCAACCCAAACCACCTACAT-3′；Actin11引物為5′-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3′和5′-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生AhAnn1基因5′序列的獲得

通過序列分析從已知抑制消減雜交文庫中獲得花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1基因片段。序列分析結(jié)果表明該已知序列缺少5′端序列，通過5′-RACE技術(shù)擴增其5′端序列。擴增片段大小為813 bp(圖1)，與設(shè)計一致，測序后獲得AhAnn1基因 5′序列，根據(jù)Kozak法則確定第一個ATG為起始密碼子。

圖1 AhAnn1基因5′-RACE PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2 花生AhAnn1基因的克隆

將獲得的5′端序列與抑制消減雜交文庫內(nèi)已知基因片段拼接得到花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1基因的全長，根據(jù)拼接得到的全長序列設(shè)計特異引物，通過RT-PCR反應(yīng)擴增得到該基因?；蛉L為1 277 bp，編碼區(qū)兩側(cè)翼分別具有5′UTR (68 bp) 和3′UTR( 258 bp)，用軟件Polyadq預(yù)測到在poly (A) 尾前115位出現(xiàn)終止信號AATAAA，代表多聚核苷酸A 合成信號。AhAnn1基因開放閱讀框為951 bp，編碼316個氨基酸合成的多肽(圖2)。利用NCBI網(wǎng)站的Protein Blast對該基因編碼的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)比對分析，結(jié)果表明，花生(Arachishypogaea)中膜聯(lián)蛋白AhAnn1與大豆(Glycinemax)、苜蓿(Medicagotruncatula)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)和木豆(Cajanuscajan)等雙子葉植物中的膜聯(lián)蛋白同源性達(dá)80%以上(圖3)。

2.3 花生AhAnn1氨基酸序列分析

對花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1基因所編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行ProtParam在線分析，結(jié)果表明，AhAnn1基因所編碼的膜聯(lián)蛋白AhAnn1的理論分子量為36.10 kDa，理論等電點PI(Isoelectric point)為7.07，親水性平均系數(shù)GRAVY(Grand average of hydropathicity)為-0.483；通過LOCtree3預(yù)測其可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，根據(jù)跨膜結(jié)構(gòu)域分析表明該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明該蛋白有4個Annexin保守結(jié)構(gòu)域，分別在16-80，87-152，172-232，245-310這4個氨基酸區(qū)域(圖4)。利用MEG 6.0軟件對花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1與其他物種膜聯(lián)蛋白Annexin進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖5)。蛋白序列聚類結(jié)果表明，AhAnn1與鷹嘴豆、木豆、大豆和苜蓿(Medicagotruncatula)中Annexin蛋白聚于同一個進(jìn)化分支，說明它們具有較近的親緣關(guān)系；與可可(Theobromacacao)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)以及歐亞花魁(Lavaterathuringiaca)中的Annexin1

圖2 AhAnn1基因的核苷酸及氨基酸序列

圖3 Annexin氨基酸序列的多重比對

圖4 膜聯(lián)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

Md.蘋果；Pm.梅花；Si.芝麻；Jc.桐油樹； Eg.巨桉； Pt.毛果楊； Rc.蓖麻；Tc.可可樹；Gr.雷蒙德氏棉；Lt.歐亞花魁；Ah.花生； Ca.鷹嘴豆；Mt.蒺藜苜蓿；Cc.木豆；Gm.大豆。

Md.Malusdomestica； Pm.Prunusmume； Si.Sesamumindicum； Jc.Jatrophacurcase； Eg.Eucalyptusgrandis； Pt.Populustrichocarpa； Rc.Ricinuscommunis；Tc.Theobromacacao；Gr.Gossypiumraimondii；Lt.Lavaterathuringiaca；Ah.Arachishypogaea；Ca.Cicerarietinum；Mt.Medicagotruncatula；Cc.Cajanuscajan；Gm.Glycinemax.

圖5 不同物種Annexin蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

Fig.5 Phylogenetic analysis of Annexin proteins in different species

蛋白相距較遠(yuǎn)；與梅花(Prunusmume)、蘋果(Malusdomestica)和芝麻(Sesamumindicum)中的Annexin1蛋白則相距更遠(yuǎn)。

2.4 花生中AhAnn1基因的表達(dá)分析

對不同組織中表達(dá)情況進(jìn)行分析表明，根系中表達(dá)量最低，葉片中表達(dá)量是根系中表達(dá)量的近2倍，莖中表達(dá)量最高，分別是根系和葉片中的15.0，7.5倍(圖6)。表1表明，隨干旱脅迫程度的增加，根系中AhAnn1的表達(dá)量增加幅度高于葉片和莖中的表達(dá)量增加幅度。與對照相比，中度干旱脅迫45%FC時根系中表達(dá)量是對照的10倍，而重度干旱脅迫20%FC處理是中度干旱脅迫45%FC處理下的2.5倍，葉片中的表達(dá)與根系中的相似，隨干旱脅迫程度的增加而增加，而在重度干旱脅迫20%FC下莖中的表達(dá)量低于中度干旱脅迫45%FC。

圖6 AhAnn1基因在不同組織中的表達(dá)

組織Tissues對照Control中度干旱脅迫(45%FC)Moderatedroughtstress重度干旱脅迫(20%FC)Severedroughtstress根Root1.00±0.0610.14±0.9925.31±2.33葉Leaf1.00±0.045.25±0.3714.16±0.32莖Stem1.00±0.0712.22±0.2910.40±0.32

3 討論與結(jié)論

植物膜聯(lián)蛋白Annexin大小為32～34 kDa，其典型結(jié)構(gòu)為4個重復(fù)單元，每一重復(fù)由大約70個氨基酸殘基組成。動物膜聯(lián)蛋白中至少有3個重復(fù)單元是高度保守的，而植物膜聯(lián)蛋白只有第1個或第4個重復(fù)單元含有“K-G-X-G-T-(38個可變殘基)-D/E”序列，該序列是典型的Ⅱ型Ca2+結(jié)合位點，為膜聯(lián)蛋白的內(nèi)聯(lián)蛋白序列[19-22]。本研究從花生中克隆得到膜聯(lián)蛋白AhAnn1基因，編碼316個氨基酸。對蛋白序列進(jìn)行分析表明，花生中Annexin蛋白在16-80，87-152，172-232，245-310這4個氨基酸區(qū)域具有典型的植物膜聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，第1個重復(fù)單元具有膜聯(lián)蛋白的內(nèi)聯(lián)蛋白序列。利用NCBI的Protein Blast功能分析表明AhAnn1蛋白與大豆、苜蓿、鷹嘴豆等豆科植物膜聯(lián)蛋白相似性高達(dá)80%以上，且通過進(jìn)化樹分析表明與以上豆科植物的膜聯(lián)蛋白具有較近的親緣關(guān)系。由此表明，本研究克隆得到的花生膜聯(lián)蛋白AhAnn1基因?qū)儆谥参顰nnexin基因家族的成員，與已有報道中的植物膜聯(lián)蛋白Annexin基因在抵抗逆境脅迫中具有類似功能。

蛋白在細(xì)胞中的定位與其功能的發(fā)揮具有密切聯(lián)系，多數(shù)研究表明植物膜聯(lián)蛋白Annexin定位于細(xì)胞質(zhì)中，但也有該類蛋白在質(zhì)膜、內(nèi)膜系統(tǒng)以及核膜定位的報道[20]。Peltier等[23]研究表明，擬南芥膜聯(lián)蛋白AtAnn1定位于液泡膜和葉綠體上；豌豆和苜蓿的部分膜聯(lián)蛋白被發(fā)現(xiàn)定位在核膜上[24-25]。通過蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位工具預(yù)測花生中AhAnn1可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，下一步將通過基因槍轟擊洋蔥表皮觀察GFP瞬時表達(dá)驗證花生中AhAnn1的亞細(xì)胞定位情況。植物Annexin參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及應(yīng)答逆境脅迫等重要的生理活動[26]，通常表現(xiàn)為發(fā)育相關(guān)和組織特異性表達(dá)[27-28]。水稻體內(nèi)膜聯(lián)蛋白受低溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[11]，擬南芥膜聯(lián)蛋白表達(dá)和豐度受干旱脅迫的調(diào)節(jié)[9，13]，ABA顯著增加AtAnn1的表達(dá)量。油菜AnnBn1基因與干旱脅迫相關(guān)，在干旱脅迫下的表達(dá)水平隨脅迫時間延長而升高[29]。本研究實時熒光定量PCR 結(jié)果顯示，花生中AhAnn1基因在莖中表達(dá)量最高，這與前人的研究結(jié)果相一致[30]。根系和葉片中花生AhAnn1基因的表達(dá)量隨干旱脅迫程度的增加而增加，而莖中的表達(dá)量在嚴(yán)重干旱脅迫下表達(dá)量低于中度干旱脅迫。下一步將利用實時熒光定量PCR技術(shù)研究不同逆境脅迫下基因表達(dá)分析，同時構(gòu)建植物表達(dá)載體，研究AhAnn1過量和抑制表達(dá)時花生或擬南芥植株對逆境脅迫的響應(yīng)。

本研究以花生為材料，克隆得到花生AhAnn1基因，該基因開放閱讀框為951 bp，編碼316個氨基酸。該基因編碼的蛋白與大豆(Glycinemax)、苜蓿(Medicagotruncatula)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)和木豆(Cajanuscajan)等雙子葉植物中的膜聯(lián)蛋白同源性達(dá)80%以上，具有4個Annexin保守結(jié)構(gòu)域。AhAnn1基因在根系中的表達(dá)量最低，在莖中的表達(dá)量是根系中的15.0倍；根系和葉片中花生AhAnn1基因的表達(dá)量隨干旱脅迫程度的增加而增加，而莖中的表達(dá)量在嚴(yán)重干旱脅迫下表達(dá)量低于中度干旱脅迫。由此表明，克隆得到的AhAnn1基因是一種干旱脅迫應(yīng)答基因，在花生逆境調(diào)控中發(fā)揮作用。

[1] Moss S E，Morgan R O.The annexins[J].Genome Biology，2004，5(4)：219-226.

[2] Clark G B，Morgan R O，F(xiàn)ernandez M P，et al.Evolutionary adaptation of plant annexins has diversified their molecular structures，interactions and functional roles[J].The New Phytologist，2012，196(3)：695-712.

[3] 王 希， 李 勇， 朱延明， 等.野生大豆脅迫應(yīng)答膜聯(lián)蛋白基因的克隆及脅迫耐性分析[J].作物學(xué)報，2010，36(10)：1666-1673.

[4] Jami S K，Clark G B，Ayele B T，et al.Genome-wide comparative analysis of annexin superfamily in plants[J].PLoS One，2012，7(11)：e47801.

[5] Zhou M L，Yang X B，Zhang Q，et al.Induction of annexin by heavy metals and jasmonic acid inZeamays[J].Functional & Integrative Genomics，2013，13(2)：241-251.

[6] 王雨晴， 張 帆， 李瑞梅， 等.木薯MeAnn1基因的克隆及表達(dá)分析[J].分子植物育種，2015，13(11)：2477-2483.[7] 李殿波， 王晉芳， 石 錦， 等.黃瓜膜聯(lián)蛋白基因CsANN2的克隆和表達(dá)分析[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，20(3)：82-89.

[8] Jami S K，Clark G B，Ayele B T，et al.Identification and characterization of annexin gene family in rice[J].Plant Cell Reports，2012，31(5)：813-825.

[9] Cantero A，Barthakur S，Bushart T J，et al.Expression profiling of theArabidopsisannexin gene family during germination，de-etiolation and abiotic stress[J].Plant Physiology and Biochemistry，2006，44(1)：13-24.

[10] Kreps J A，Wu Y，Chang H S，et al.Transcriptome changes forArabidopsisin response to salt，osmotic，and cold stress[J].Plant Physiology，2002，130(4)：2129-2141.

[11] Hashimoto M，Toorchi M，Matsushita K，et al.Proteome analysis of rice root plasma membrane and detection of cold stress responsive proteins[J].Protein and Peptide Letters，2009，16(6)：685-697.

[12] Weber M，Trampczynska A，Clemens S.Comparative transcriptome analysis of toxic metal responses inArabidopsisthalianaand the Cd2+-hypertolerant facultative metallophyteArabidopsishalleri[J].Plant，Cell & Environment，2006，29(5)：950-963.[13] Konopka-Postupolska D，Clark G，Goch G，et al.The role of annexin 1 in drought stress inArabidopsis[J].Plant Physiology，2009，150(3)：1394-1410.

[14] Renaut J，Hausman J F，Wisniewski M E.Proteomics and low-temperature studies：bridging the gap between gene expression and metabolism[J].Physiologia Plantarum，2006，126(1)：97-109.

[15] Jami S K，Clark G B，Turlapati S A，et al.Ectopic expression of an annexin fromBrassicajunceaconfers tolerance to abiotic and biotic stress treatments in transgenic tobacco[J].Plant Physiology and Biochemistry，2008，46(12)：1019-1030.

[16] Hsiao T C.Plant responses to water stress[J].Annual Review of Plant Physiology，1973，24(1)：519-570.

[17] 黎 裕.作物抗旱鑒定方法與指標(biāo)[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，1993，11(1)：91-99.

[18] 陳 娜， 潘麗娟， 遲曉元， 等.花生果糖-1，6-二磷酸醛縮酶基因AhFBA1的克隆與表達(dá)[J].作物學(xué)報，2014，40(5)：934-941.

[19] Hofmann A，Delmer D P，Wlodawer A.The crystal structure of annexin Gh1 fromGossypiumhirsutumreveals an unusual S3 cluster-Implications for cellulose synthase complex formation and oxidative stress response[J].European Journal of Biochemistry，2002，270(12)：2557-2564.

[20] Mortimer J C，Laohavisit A，Macpherson N，et al.Annexins：multifunctional components of growth and adaptation[J].Journal of Experimental Botany，2008，59(3)：533-544.

[21] Creutz C E，Pazoles C J，Pollard H B.Identification and purification of an adrenal medullary protein (synexin) that causes calcium-dependent aggregation of isolated chromaffin granules[J].The Journal of Biological Chemistry，1978，253(8)：2858-2866.

[22] 何美敬， 穆國俊， 侯名語， 等.植物膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)及功能研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報，2013，33(12)：2567-2574.

[23] Peltier J B，Cai Y，Sun Q，et al.The oligomeric stromal proteome ofArabidopsisthalianachloroplasts[J].Molecular & Cellular Proteomics，2006，5(1)：114-133.

[24] Clark G B，Dauwalder M，Roux S J.Immunological and biochemical evidence for nuclear localization of annexin in peas[J].Plant Physiology and Biochemistry，1998，36(9)：621-627.

[25] Niebel F D，Lescure N，Cullimore J V，et al.The medicago truncatulaMtAnn1 gene encoding an annexin is induced by nod factors and during the symbiotic interaction withRhizobiummeliloti[J].Molecular Plant-microbe Interactions：1998，11(6)：504-513.

[26] Gerke V，Moss S E.Annexins：from structure to function[J].Physiological Reviews，2002，82(2)：331-371.

[27] Jami S K，Dalal A，Divya K，et al.Molecular cloning and characterization of five annexin genes from Indian mustard (BrassicajunceaL.Czern and Coss) [J].Plant Physiology and Biochemistry，2009，47(11/12)：977-990.

[28] Lu Y，Ouyang B，Zhang J，et al.Genomic organization，phylogenetic comparison and expression profiles of annexin gene family in tomato (Solanumlycopersicum) [J].Gene，2012，499(1)：14-24.

[29] 肖慶生， 張學(xué)昆， 許本波， 等.甘藍(lán)型油菜AnnBn1基因的克隆和表達(dá)分析[J].中國油料作物學(xué)報，2012，34(2)：123-128.

[30] He M，Yang X，Cui S，et al.Molecular cloning and characterization ofannexingenes in peanut (ArachishypogaeaL.) [J].Gene，2015，568(1)：40-49.

Cloning and Expression ofAhAnn1 Gene in Peanut

DING Hong，DAI Liangxiang，QIN Feifei，CI Dunwei，SONG Wenwu，ZHANG Zhimeng

(Shandong Peanut Research Institute，Qingdao 266100，China)

The aim of this study was to screenAnnexingenes related to stress resistance in peanut.AAnnexingene was cloned from the peanut (Huayu 25)，namedAhAnn1 using RACE technology and RT-PCR.The peanut Annexin like gene was obtained from drought related suppression subtractive hybridization cDNA library in peanut root.The whole sequence ofAhAnn1 was 1 277 bp and its open reading frame was 951 bp，encoding a polypeptide of 316 amino acids，with a theoretical molecular weight of 36.10 kDa and an isoelectric point(pI) of 7.07.The protein was predicted to be located in cytoplasm，containing the conserved Annexin domain.Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis of Annexin proteins indicated AhAnn1 was most similar with Annexin fromGlycinemax，MedicagotruncatulaandCicerarietinum.The results of Real-time RT-PCR showed that the expression ofAhAnn1 in roots and leaves increased with the increase of drought stress.This suggested thatAhAnn1 was a drought stress response gene，which played an important role in the regulation of peanut stress.This study provides a theoretical basis for further studying the peanutAhAnn1 gene function and elucidating the molecular mechanism of stress resistance in peanut.

Peanut；Annexin； Drought； Phylogenetic analysis； Real-time PCR

2017-02-27

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)計劃項目；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目(BS2012NY010)；國家自然科學(xué)基金項目(31201171)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系花生創(chuàng)新團(tuán)隊(SDAIT-04-06)

丁 紅(1983-)，女，江蘇海安人，助理研究員，博士，主要從事花生逆境生理研究。

張智猛(1963-)，男，河北衡水人，研究員，博士，主要從事花生栽培生理生態(tài)研究。

Q78；S565.03

A

1000-7091(2017)03-0021-06

10.7668/hbnxb.2017.03.004