花生MAPK基因的篩選和鹽脅迫分析

孔祥遠，陳冠旭，秦貴龍，隋炯明，喬利仙，王晶珊，徐麗麗

(青島農業大學 生命科學學院，山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東 青島 266109)

花生MAPK基因的篩選和鹽脅迫分析

孔祥遠，陳冠旭，秦貴龍，隋炯明，喬利仙，王晶珊，徐麗麗

(青島農業大學 生命科學學院，山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東 青島 266109)

促有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生長發育及抗逆脅迫過程中發揮重要作用。為了解花生中MAPK基因的情況，利用RNA測序技術對花生耐鹽突變體(S2)和對照(S4)進行了轉錄組分析，篩選出了14個MAPK基因，位于花生野生種基因組A組的6條染色體上。聚類分析表明，花生14個MAPK基因中13個可以聚到已報道的4個亞類中。利用花生S2和S4構建了鹽脅迫處理前后的表達譜，根據調整后的P值，篩選出6個MAPK基因在S2和(或)S4受鹽脅迫誘導表達，分別屬于A(1個)和D亞類(5個)。為花生MAPK基因的功能驗證和利用奠定了基礎。

花生；MAPK基因；鹽脅迫；RNA測序

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯反應是重要的信號通路之一，在植物的生長發育過程起著重要作用[1]。MAPK級聯反應涉及MAPK、MAPKK和MAPKKK 3個蛋白激酶。MAPK傳導通路主要過程為：MAPKKK被磷酸化后激活MAPKK，MAPKK被磷酸化之后再激活MAPK，最后由MAPK對細胞的生理周期進行一系列的調控，其中MAPK是位于級聯途徑的最下游區域[2]。

MAPK基因與某些生物和非生物脅迫有著密切關系。擬南芥的AtMAPK基因在抵抗非生物脅迫和病害中有重要作用[3-5]。將玉米中ZmMAPK1基因轉到擬南芥中可提高轉基因植株抵抗干旱和熱脅迫的能力[6]。亞麻LuMAPK基因受鹽堿脅迫誘導表達[7]。GhMAP16是棉花MAPK基因D組中一個新的脅迫響應基因，轉入擬南芥后可提高轉基因植株的抗旱和抗病能力[8]。煙草的17個NtMAPK基因在植株防御病害中有重要作用，并且有6個NtMAPK基因對干旱脅迫有響應[9]。西瓜中很多ClMAPK成員對不同非生物脅迫(如干旱、鹽、冷、熱處理)有響應[10]。此外番茄和黃瓜的MAPK基因也具有抵抗非生物脅迫的作用[11-12]。

為了分析花生MAPK基因的情況，筆者構建了花生葉片轉錄組文庫，篩選了花生MAPK家族基因，并進行基因結構分析、染色體定位和聚類分析。然后利用鹽脅迫處理前后的表達譜，分析了MAPK基因在鹽脅迫處理前后表達量的變化，為了解花生MAPK基因和鹽脅迫之間的關系奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在前期試驗中，利用化學誘變(以平陽霉素為誘變劑)進行了花生離體誘變，并在含羥脯氨酸的培養基中進行定向篩選，經過多代檢測后獲得了1個穩定遺傳的耐鹽突變體(S2)，其種子在0.7% NaCl 溶液中的發芽率顯著高于對照花育20(S4)。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生葉片轉錄組數據庫構建 用250 mmol/L NaCl處理生長1個月的耐鹽突變體(S2)和對照(S4)植株，在0，6，12，24，48 h取葉片，每個樣品2次生物學重復，所有20個樣品混合后構建轉錄組文庫。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG這七大數據庫進行了基因功能注釋。

1.2.2 花生葉片表達譜數據庫構建 對上述20個樣品進行數字化表達譜測序，構建表達譜數據庫，并以上述轉錄組數據庫為參考，對表達譜數據庫Unigene序列進行分析。

1.2.3MAPK基因的篩選和分析 根據上述七大數據庫的基因功能預測，搜索MAPK基因。利用生物信息學軟件分析蛋白的分子量和理論等電點。從花生全基因組數據，并根據數據庫的預測和比對結果進行外顯子-內含子結構分析。根據與A組野生種比對后的結果，繪制每個基因在染色體上的位置。

1.2.4 系統發育樹的構建 通過ClustalX 程序對MAPK蛋白進行多序列聯配分析，序列聯配結果使用MEGA 7.0程序。采用鄰接法生成MAPK基因的系統進化樹，Bootstrap 值設置為1 000。

1.2.5 蛋白多序列的比對分析及部分保守基序(Motif)分析 使用ClustalX軟件的多序列比對功能對MAPK蛋白進行多序列比對，參數均使用默認值。使用MEME 4.11.1在線分析系統(http：//meme-suite.org/index.html)對MAPK蛋白進行保守基序預測。

1.2.6MAPK基因的鹽脅迫響應分析 將S2或S4樣品中，在0，6，12，24，48 h，某一基因在任意2個時間段間的表達量進行比較，如果達到顯著水平(調整后的P<0.05)，則認為該基因對鹽脅迫有響應。根據FPKM (Fragments kilobase of exon model per millon mapped reads)值利用軟件HemI_1.0制作熱圖。

2 結果與分析

2.1 花生MAPK基因的鑒定、結構及其在染色體位置上的分布

根據上述七大數據庫的基因功能預測結果及SMART在線工具分析其結構域，從花生葉片轉錄組數據庫篩選出23個候選MAPK基因。將其與公布的花生A組野生種基因組序列比對，其中c31753_g1、c40388_g1、c41119_g3和c44286_g1 4個基因不含有完整讀碼框且比對不到A組野生種基因組，c37067_g2與c37067_g3、c38354_g1與c43036_g1、c58235_g1與64143_g1、c30953_g1與c33764_g1、c37424_g1與c39725_g2 分別比對到同一位置，最終得到了14個完整的花生MAPK基因，其基本信息列于表1和圖1。

由表1可以看出，不同成員間氨基酸殘基個數差別很大，為206～669個，分子量為22.82～76.39 kDa，等電點在5.63～9.89，外顯子數目2～16個。除c40125_g2、c33764_g1基因編碼產物定位到葉綠體和細胞壁外，其余基因編碼產物定位到細胞核和細胞質上。

通過與花生A組野生種基因組序列比對后，發現14個MAPK基因共分布于6條染色體上，多數位于3，5號染色體上，分別有4，3個基因；1，4，7號染色體各有2個基因；2號染色體上有1個基因，其他染色體上暫時沒有發現MAPK基因(圖2)。

2.2 花生MAPK基因的聚類和基序分類

擬南芥中至少有20個MAPK基因，可分為A、B、C、D 4個亞族[10]。根據MAPK基因家族成員長度差異、含不同特征的結構域等特點，對花生14個MAPK基因與擬南芥的MAPK基因進行了多重序列比對和系統進化分析。結果表明，13個花生MAPK基因能聚到擬南芥的A、B、C、D 4個亞族中，這4個亞類分別包含1，4，1，7個基因；而c39725_g2單獨聚為一類，可能是新的成員(圖3)。

表1 14個花生MAPK 基因的基本信息

圖1 14個花生MAPK 基因的結構示意圖

通過MEME 4.11.1在線分析軟件對14個MAPK基因進行motif分析，共發現15個motif，其中motif4和motif8是14個MAPK基因共有的，c39725_g2只含有4個motif，分別為motif4、motif5、motif7、motif8。motif15只出現在c33764_g1和c37067_g3這2個基因中(圖4)。

2.3 花生MAPK基因的鹽脅迫響應分析

利用鹽脅迫處理前后的表達文庫譜，對14個MAPK基因在脅迫處理前后的任何2個時間段間的表達量進行比較，根據調整后的P值，確定其是否受鹽脅迫誘導表達。結果發現，2個基因(c42537_g2、c38354_g1)在S2和S4中均受脅迫誘導表達；4個基因(c41648_g2、c40125_g2、c33764_g1、c43948_g1)只在S2中受脅迫誘導表達。14個花生MAPK基因在各個時間段的表達量也不同，S2中FPKM值為0～94.55，S4中FPKM值的變化為0～97.04(圖 5)。c40125_g2、c42537_g2和c43948_g1在S2、S4的表達模式相同，但它們的表達曲線并不一致，c40125_g2為上調-上調-下調-上調，c42537_g2為上調-下調-下調-上調，c43948_g1為下調-下調-上調-下調。c40125_g2、c33764_g1、c41648_g2這3個基因在S2與S4的表達模式不同(圖 5)。

圖2 14個花生MAPK基因在染色體上的位置

圖3 擬南芥和花生MAPK基因的進化樹

結合聚類分析結果發現，上述6個受鹽脅迫誘導的MAPK基因涉及A和D 2個亞類，其中A亞類(1/1)和D亞類(5/7)的基因受鹽脅迫誘導表達；而B和C 2個亞類的6個基因均不受鹽脅迫誘導表達。

3 討論

MAPK基因在植物中廣泛存在，他們在幫助植物抵御非生物脅迫中發揮重要作用，有些成員在受到非生物脅迫時可被誘導表達。當植物體在經歷各種情況下的環境脅迫時，如干旱、極端溫度、輻射脅迫等[13-14]，MAPK的級聯反應能將細胞外的刺激透過細胞膜傳導到細胞膜內乃至細胞核，使膜外的刺激物與膜內的受體結合起來從而使細胞做出一系列反應[15]。MAPK的級聯反應還參與細胞的防御反應等多條途徑[5]。由此可見，深入研究MAPK的功能對于作物抗逆育種具有重要的理論和實際應用價值。目前，許多植物的MAPK基因均已被分離出，其中MAPK基因家族在擬南芥中共發現20個AtMAPK基因[16]，水稻有17個OgMAPK基因[17]，玉米有19個ZmMAPK基因[18]。煙草有17個NtMAPK基因[19]，番茄有16個SiMAPK[20]。目前在花生中還沒有關于MAPK基因的報道。

為了分析花生中MAPK基因的情況，利用花生葉片轉錄組數據庫篩出了14個MAPK基因，他們位于花生A組野生種的6條染色體上，不同染色體上的MAPK基因數目差異很大。根據已有報道，擬南芥MAPK基因可分為A、B、C、D 4個亞類，對花生的14個MAPK基因進行了聚類分析，結果表明其中13個MAPK基因分別聚到擬南芥的4個亞類中。

圖4 14個花生MAPK基因的基序分析

單位為FPKM。

利用花生耐鹽突變體(S2)和對照(S4)構建了鹽脅迫處理前后各時間段的表達譜，進行基因鹽脅迫表達分析，結果表明14個MAPK基因中6個受鹽脅迫誘導表達，這6個基因涉及A和D 2個亞類，D亞類中受鹽脅迫誘導表達的成員最多(5個)，同一亞家族內的基因表達模式并不完全相同；而B和C亞類中的6個成員均不受鹽脅迫誘導。本試驗為今后花生中MAPK基因的研究與利用提供了理論依據。

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Screening and Salinity Stress Analysis ofMAPKGenes in Peanut

KONG Xiangyuan，CHEN Guanxu，QIN Guilong，SUI Jiongming，QIAO Lixian，WANG Jingshan，XU Lili

(College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong，Qingdao 266109，China)

Mitogen activated protein kinase (MAPK) plays an important role in plant growth and development，and stress resistance in plant.In order to improve our understanding of theMAPKgenes in peanut，RNA-seq was used to analyze one transcriptomic library constructed using a mutant with higher salinity resistance (S2) and its control (S4) in this study，14MAPKgenes were screened and located on six chromosomes of A genome from wild species.Clustering analysis showed that 13 out of 14MAPKgenes were assorted to four subgroups reported previously.Digital gene expression profiles were constructed using S2 and S4 samples before and after salinity treatment，according to the adjustedPvalue，sixMAPKgenes were found to be responsive to salinity treatment in S2 and (or) S4，which belonged to A (1)and D (5) subgroups，respectively.This study can provide the basis for functional identification and application ofMAPKgenes in peanut.

Peanut；MAPKgene；Salinity stress；RNA-seq

2017-03-25

國家自然基金項目(31571705；31301356；31471542)；山東省科技發展計劃項目(2014GNC110002)

孔祥遠(1989-)，男，山東菏澤人，在讀碩士，主要從事作物分子育種研究。

徐麗麗(1979-)，女，山東諸城人，講師，碩士，主要從事基因工程研究。

Q78；S565.03

A

1000-7091(2017)03-0027-06

10.7668/hbnxb.2017.03.005