大葉落地生根細胞周期蛋白依賴激酶KdCDK基因克隆及表達分析

朱敏群，梁小紅，黃慧青，歐素榮，葛永強，張利娟，鐘天秀

(1.深圳市日昇園林綠化有限公司，廣東 深圳 518040；2.北京林業大學 林學院 草坪研究所，北京 100083；3.暨南大學 深圳旅游學院，廣東 深圳 518053；4.華南農業大學 林學與風景園林學院，廣東省草業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

大葉落地生根細胞周期蛋白依賴激酶KdCDK基因克隆及表達分析

朱敏群1，梁小紅2，黃慧青1，歐素榮1，葛永強1，張利娟3，鐘天秀4

(1.深圳市日昇園林綠化有限公司，廣東 深圳 518040；2.北京林業大學 林學院 草坪研究所，北京 100083；3.暨南大學 深圳旅游學院，廣東 深圳 518053；4.華南農業大學 林學與風景園林學院，廣東省草業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

為了更好理解大葉落地生根中細胞周期調控的分子機制，利用RACE-PCR技術從大葉落地生根中克隆了1個新的基因KdCDK。該基因編碼295個氨基酸殘基，分子量為34.12 kDa，等電點為6.15，其開放閱讀框長度為888 bp。其蛋白與筍瓜CDK蛋白的同源性最高，屬于CDKA類蛋白家族。實時熒光定量PCR分析表明，該蛋白基因在大葉落地生根的根中表達量最高，且受滲透脅迫(甘露醇)的誘導上調表達。從大葉落地生根中克隆出KdCDK基因，為將來該基因的功能研究打下了基礎。

大葉落地生根；細胞周期蛋白依賴激酶；基因表達

細胞周期是受到嚴格調控的過程，通過一系列不連續的關鍵點來確保DNA正確復制和細胞的成功分裂。真核生物中的細胞周期由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族調控，最常見的就是細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)[1-3]。CDKs活性調節主要有以下3種方式：磷酸化和去磷酸化、結合相互作用蛋白如細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(ICK)或細胞周期蛋白依賴激酶活化蛋白(CAK)、結合細胞周期蛋白[4-5]。到目前為止，從41種植物中克隆出152個CDK基因，根據與細胞周期蛋白結合位點基序的差異把它們分為8個亞家族，包括CDKA～G和CDKL(類細胞周期蛋白依賴激酶)[6-7]。CDKA類蛋白家族含有PSTAIRE特征的序列，CDKB類蛋白家族含有PPTALRE或PPTTLRE特征序列，CDKC類蛋白家族含有具有PITAIRE特征序列，CDKD、CDKE和CDKF類蛋白家族調控CDK活化子，含有SPTAIRE特征序列，CDKG類蛋白家族含有PLTSLRE特征序列，CDKL類蛋白家族含有(V、I、L、K、R)FMAREI特征序列，根據基序中氨基酸殘基的變化將CDKL分為CDKL1～CDKL15[6]。

第一個CDK激酶是在酵母中發現的，酵母中cdc2/cdc28突變體的表型能夠完全被CDKA修復，說明單一的CDK基因就能完全調控酵母的細胞周期[8]。到現在為止，已有大量的研究表明CDKA在受精胚發育早期和體細胞胚發育過程中起到了至關重要的作用[9-10]。過表達CDKA∶1的植株沒有出現表型上的改變，但是該基因的顯性失活突變體抑制轉基因煙草中細胞周期過程，使細胞分裂速度下降，細胞變大，植株矮小[11]。在擬南芥中，cdc2At基因的顯性突變體(與CDKA∶1是同源基因)中細胞周期蛋白依賴激酶失活，細胞周期活動受到抑制，植株無法存活[11]；而該基因的顯性失活突變體影響胚胎形成過程，C13株系不能形成種子，其他株系C1、C5、C12中胚胎上下軸模式(Apical-basal embryo pattern)出現畸形[11]。Nowack等[12]的研究都表明CDKA∶1基因完全被敲掉之后會導致胚胎死亡，花粉粒中出現雙細胞或者三細胞的精細胞。最近一項研究表明，CDKA∶1基因不僅在細胞進入有絲分裂間期中的S期中有非常重要的作用，而且具有促進根中的細胞增殖使根發育完整并維持根中分生組織的功能[12]。

大葉落地生根胎生苗的發育過程兼具胚胎發生途徑和器官發生途徑，是研究植物發生發育的理想模型[13]。為揭示大葉落地生根胎生苗發育機制，采用抑制消減雜交技術(SSH)構建了大葉落地生根胎生苗和普通葉片的SSH-cDNA文庫[14]，并從該差減文庫中篩選出一條與細胞周期蛋白依賴激酶基因片段同源的表達序列標簽(EST)。本研究以該EST片段為基礎，采用RACE-PCR技術克隆出大葉落地生根細胞周期蛋白依賴激酶的cDNA基因全長(命名為KdCDK)，利用生物信息學方法分析KdCDK基因的序列、蛋白結構、系統發育，并研究該基因在大葉落地生根不同組織和滲透脅迫誘導下的表達變化，為該基因的進一步研究利用打下了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料的培養

大葉落地生根(Kalanchoedaigremontiana)種植于北京林業大學草坪研究所溫室，培養基質為腐葉土、蛭石和珍珠巖(按4∶2∶1混合)，在16 h光照/8 h黑暗，光照強度為25 μmol/(m2·s)，溫度為(30±3)℃下培養。采集葉片后快速在液氮中固定，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 總RNA的提取以及反轉錄

使用TaKaRa MiniBEST universal RNA Extraction Kit(Code No.9769)提取落地生根葉片的總RNA，并在-80 ℃下保存。

1.3KdCDK基因的克隆和測序

根據差減文庫的測序結果，分別設計上游引物F1和下游引物R1(表1)。以總RNA為模板，按照PrimeScriptTMⅡ High Fidelity RT-PCR Kit(TaKaRa Code No.RO23A)的操作說明合成第一鏈cDNA，使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，包括1 μL cDNA模板，1 μL Tks Gflex DNA Polymerase(1.25 U/μL)，1 μLF1引物(20 μmol/L)，1 μLR1引物(20 μmol/L)，25 μL 2×Gflex Buffer(Mg2+，dNTP plus)，21 μL ddH2O 。反應程序為： 98 ℃變性 10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃ 延伸1 min，共30個循環。以上述PCR產物為模板，進行2次PCR，反應體系及條件同上。取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.9762)回收，用F1/R1為特異引物對回收后的DNA測序。

根據獲得的CDK基因cDNA片段序列設計5′RACE Outer PCR特異引物R01和Inner PCRR02(表1)。使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech Cat.No.634923)對反轉錄總RNA合成cDNA。使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進行PCR擴增。Outer PCR反應完成后，立即取反應液1 μL進行Inner PCR反應。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.9762)回收。接著用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.1(Code No.6022)中的連接酶，將PCR產物與T-Vector pMDTM18(Code No.3271)進行連接，熱轉化至大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態細胞JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37 ℃過夜培養。挑選陽性菌落，提取質粒，用M13-47引物對進行測序。由于第1次5′RACE 結果不理想，重新設計引物，進行再次5′RACE。5′RACE Outer PCR特異引物R06和Inner PCRR07見表1。具體操作同第1次5′RACE過程。

根據獲得的CDK基因cDNA片段序列設計3′RACE Outer PCR特異引物F01和Inner PCR特異引物F02(表1)。以1 μL的RNA為模板，使用3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase(Code No.6106)反轉錄合成cDNA。使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進行PCR反應。2輪PCR反應完成后，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。經切膠回收和連接克隆，用M13-47引物對質粒進行測序分析。具體步驟同5′RACE。

對CDK基因cDNA片段的5′端和3′序列進行拼接，獲得KdCDK基因的全長序列。并分別設計上游引物YZF1和YZF2及下游引物YZR1(表1)，以驗證試驗中使用的cDNA為模板，進行2輪PCR反應。第1輪PCR反應使用引物YZF1和YZR1。第2輪PCR反應使用YZF2和YZR1。使用TaKaRa Tks Gflex DNA polymerase(Code No.R060A)進行PCR擴增。取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。用YZR1進行測序分析。

1.4KdCDK基因的生物信息學分析

應用NCBI數據庫中ORF Finder軟件尋找KdCDK序列中的ORF，推導編碼的氨基酸序列。應用Expasy的ScanProstie、ProtParam、TMpred、Protscale程序分析KdCDK蛋白的保守結構域、分子量和等電點、跨膜結構域和親疏水性[15]。用Blast程序檢索相似蛋白，利用ClustalX 2.1 軟件對不同物種的氨基酸序列進行多重比對[16]；利用MEGA 6.0進行氨基酸序列分析，用鄰接法構建進化樹，并用Bootstrap校正[17]；根據NPS@ web server網站中的PHD方法預測蛋白的二級結構[18]。應用在線分析工具Phyre分析CDK蛋白三級結構[19]。

1.5KdCDK表達的熒光定量分析

以大葉落地生根actin作為內參基因(上下游引物見表1)，根據KdCDK的序列信息設計設計熒光定量的上游引物F2和下游引物R2(表1)。以大葉落地生根中的根、莖、葉、葉柄為總RNA材料分析KdCDK基因在不同組織中的表達情況。對大葉落地生根幼苗進行滲透脅迫處理(300 mmol/L甘露醇)，分別在處理的0，3，6，9，12，24 h采集葉位相同葉片，每個處理設3個重復，3個重復混合取樣，提取總RNA分析KdCDK基因在滲透脅迫下的表達情況。按照Ist Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒的操作說明合成cDNA，根據SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進行PCR擴增。熒光定量反應體系為：SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(2×)Universal 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA 1 μL，ROX校正染料 0.2 μL，dH2O 3.4 μL，共10 μL。反應在ABI7900HT實時定量PCR儀上進行，反應條件為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s。采用2-ΔΔCT法分析結果。

表1 KdCDK基因克隆和鑒定中所用的引物序列

2 結果與分析

2.1KdCDKcDNA克隆與測序

以大葉落地生根葉片第一鏈cDNA為模板，并用引物F1和R1進行PCR擴增，獲得約150 bp的目的片段(圖1-A)。根據獲得的SAHH基因cDNA片段序列分別設計3′RACE和5′RACE特異引物，獲得約600，200 bp的目的片段(圖1-B、C)。由于測序結果不理想，再次設計引物進行5′RACE試驗，獲得約1 000 bp的目標片段，電泳檢測結果如圖1-D。將獲得的cDNA片段的5′端和3′端序列進行拼接，以大葉落地生根葉片第一鏈cDNA為模板，設計驗證引物，獲得約1 200 bp的目的片段(圖1-E)。因此，大葉落地生根CDK基因的cDNA全長為1 437 bp(GenBank登錄號：KU740360)，命名為KdCDK，含有888 bp完整開放閱讀框(ORF)，編碼295個氨基酸(圖2)，不包括PolyA尾的長度為1 426 bp，5′UTR(非編碼區)361 bp，3′UTR 176 bp。

M.D2000 DNA Marker；A.根據差減文庫的結果設計引物驗證KdCDK基因；B.3′ RACE 結果；C.5′ RACE 結果；D.再次5′RACE結果；E.RACE結果驗證。

M.D2000 DNA Marker；A.Validation fragments ofKdCDKgene according to the results of subtractive library；B.The result of 3′ RACE；C.The result of 5′ RACE；D.The result of second 5′ RACE；E.The verification of RACE results.

圖 1 大葉落地生根KdCDK同源擴增和RACE 克隆以及序列驗證

Fig.1 RT-PCR amplification，RACE cloning and sequence verification ofKdCDKgene in

Kalanchoedaigremontiana

下劃線ATG為起始密碼子；方框TGA為終止密碼子；灰色陰影部分為蛋白激酶ATP結合信號區域;虛線部分為CDKA類蛋白的特征序列;雙下劃線為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點信號序列。

2.2 KdCDK 序列分析及系統進化樹的構建

KdCDK與筍瓜(CBJ18166.1)、陸地棉(ABV64386.1)、毛果楊(XP 002306004.1)、金魚草(CAA66233.1)的相似性分別為68%，67%，66%，65%。通過ScanProsite在線軟件分析，發現該蛋白具有2個保守的結構域：蛋白激酶ATP結合區域信號序列(10-33)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點信號序列(123-135)。含有保守的基序(motif)“PSFALRE”，與CDKA蛋白激酶類似，是細胞周期蛋白的結合位點。通過SIB中的Motif Scan，預測得到一些不同的基序，包括1個SANT 保守域(1-12)、2個蛋白酪氨酸激酶(4-20、49-152)、2個酪氨酸激酶磷酸化位點(8-15、280-287)、3個MYRISTYL N-豆蔻酰化位點(114-119、148-153、191-196)、4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(70-73、93-96、183-186、222-225)、5個蛋白激酶C磷酸化位點(25-27、120-122、141-143、274-276、278-280)。

將大葉落地生根KdCDK與其他25種植物中的CDKA進行了氨基酸序列比對，可以看出，不同植物CDK氨基酸序列在幾個重要功能位點的序列保守性程序很高，如蛋白激酶ATP-結合區域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點、T-Loop區域(圖3)。利用Mega 6.0中的相鄰連接法構建系統進化樹(圖4)，采用默認參數，自檢舉1 000次，對生成的系統進化樹進行Bootstrap校正。結果表明，KdCDK與CDKB類蛋白完全分開，與其他植物中的CDKA類蛋白同屬于一類。雙子葉、單子葉、裸子植物中的CDKA類聚為一類，而大葉落地生根的CDK蛋白單獨聚為一類。

2.3 KdCDK的理化性質及三級結構預測

KdCDK蛋白的理論分子量為34.12 kDa，理論等電點為6.15。脂溶指數為92.51，總平均親水性(GRAVY)為-0.188，不穩定系數為34.51，表明該蛋白是一個穩定的蛋白。二級結構預測結果表明，KdCDK含有48.47%的α-螺旋，20.68%的β-折疊和30.85%的隨機卷曲(圖5，6)，沒有信號肽及其剪切位點，是水溶性的非分泌型蛋白，有1個明顯的跨膜區(表2)，被定位于細胞質中。

圖3 大葉落地生根細胞周期蛋白依賴激酶與其他植物的細胞周期蛋白依賴激酶氨基酸序列比對

圖4 大葉落地生根細胞周期蛋白依賴激酶與其他植物細胞周期蛋白依賴激酶氨基酸序列的進化分析

數字代表氨基酸;最長的細線代表α-螺旋；中等長度的細線代表β-折疊。

通過Phyre在線預測網站預測的三維結構表明，KdCDK具有細胞周期蛋白依賴激酶典型的三維結構，包括2個小葉結構，一個小葉主要由α-螺旋構成，另一個小葉由α-螺旋和β-折疊構成。共有11個α-螺旋和8個β-折疊(圖6)。

表2 KdCDK 跨膜區域

螺旋為α-螺旋；箭頭為β-折疊；曲線為無規則卷曲。

2.4KdCDK的組織表達分析

利用熒光實時定量PCR對KdCDK在大葉落地生根中的表達情況進行檢測，結果如圖7所示，KdCDK在根中表達量最高，大約是葉中的1.6倍。根、葉、葉柄、莖中KdCDK的表達量沒有明顯差異。這些結果表明，KdCDK在各組織中均有表達，但不具有組織特異性。

圖7 KdCDK在大葉落地生根中不同組織中的表達

2.5KdCDK的誘導表達分析

用300 mmol/L甘露醇對大葉落地生根進行滲透脅迫，以實時熒光定量PCR法分析其表達動態(圖8)。結果顯示，KdCDK在甘露醇處理下存在上調表達的趨勢。在處理 24 h后，KdCDK的表達量達到最大值。

圖8 KdCDK在滲透脅迫下的表達

3 討論

目前，已經從不同的植物中克隆出大量的CDK類基因。本研究從大葉落地生根中克隆出CDK基因序列含有888 bp完整開放閱讀框，編碼的蛋白質與筍瓜、陸地苗、毛白楊等植物中的CDKA類蛋白相似性都很高[20]。對CDKA類蛋白進行比對分析發現該類蛋白5′端相對保守，而在3′端差異比較大，說明A類CDK蛋白家族的氨基酸序列相對保守。而且，進化樹比對分析結果表明大葉落地生根細胞周期依賴激酶屬于CDKA類蛋白聚在一起，與CDKB類蛋白完全分開，與Zhang等[21]的研究結果一致。所有這些結果說明KdCDK是一個新的CDKA類基因，與之前報道的植物CDKA類基因在序列信息上有諸多相似之處。

一般情況下，根據不同的基序推測蛋白的生物學功能。在KdCDK中，含有“PSFALRE”，與植物中A型CDK類的典型基序“PSTAIRE”十分相似，推測KdCDK屬于CDKA類蛋白，并具有相應的功能。KdCDK特征序列中存在2個氨基酸突變，可能是因為大葉落地生根特殊的繁殖方式。在KdCDK中，也存在其他的保守區域，如蛋白激酶ATP結合區域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點，這些都與維持CDK的功能密切相關?？偟膩碚f，通過對KdCDK保守區域的預測可以推測，它的功能應該類似于植物中其他CDKA類蛋白[22-23]。但是，KdCDK蛋白的具體功能還需從生物化學和基因角度去探究。

通過蛋白三維結構建模分析蛋白結構有利于蛋白的功能分析。目前，CDKs家族蛋白結構建模主要集中在酵母和人上[23-25]。KdCDK蛋白的三維結構是在人類CDK結構(PDB code：d1unla)的基礎上進行建模，與其他植物的CDK蛋白結構相似，2個小葉結構都以α-螺旋和β-折疊為主要構件，無規則卷曲為連接方式，圍繞著一個中心激活區域。這說明大部分CDK，特別是CDKA類蛋白進化出類似的三維結構[26]。

植物中的CDKA類基因轉錄本大部分是在組織分裂細胞中表達量較高，比如頂芽、根尖、發育的葉片和花器官組織[27]。非生物脅迫如機械損傷能提高葉中CDKA的表達量[27]。本研究中，KdCDK的表達量在根中最高，說明組織中KdCDK的表達量與細胞分裂和分化的類型有關[28]。在滲透脅迫下，KdCDK的表達量逐漸升高，說明KdCDK的表達量與非生物脅迫有關[29-32]。

本研究對大葉落地生根細胞周期蛋白依賴激酶進行克隆和生物信息學分析，證明該基因在序列結構和功能上與植物CDKA類蛋白類似，在分裂組織(根)中表達量最高，并且受滲透脅迫的誘導，說明KdCDK可能在大葉落地生根根發育和抵抗非生物脅迫的過程中起到一定的作用，關于KdCDK在大葉落地生根中的具體功能還需要進一步的試驗進行驗證。

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cDNA Cloning and Expression Analysis of Cyclin-dependent Kinase (KdCDK)Gene inKalanchoedaigremontiana

ZHU Minqun1，LIANG Xiaohong2，HUANG Huiqing1，OU Surong1，GE Yongqiang1，ZHANG Lijuan3，ZHONG Tianxiu4

(1.Shenzhen Risheng Landscape Company Limited，Shenzhen 518040，China；2.Turfgrass Research Institute，The College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；3.Shenzhen Tourism College of Ji′nan University，Shenzhen 518053，China；4.College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangdong Engineering Research Center of Grassland Science，Guangzhou 510642，China)

To better understand the molecular mechanisms of CDKs involved inKalanchoedaigremontiana，an A-Type CDK gene，KdCDK，was identified using rapid amplification of cDNA end(RACE)PCR.KdCDKgene consists of an ORF of 888 bp that was predicted to encode a 295 amino acid residue-long protein of 34.12 kDa with an isoelectric point of 6.15.KdCDK was related most closely to CmCDK and was clustered to CDKA subfamily.Real-time PCR analysis revealed thatKdCDKtranscript was expressed highly in root and upregulated under osmotic stress.This study characterized the novelKdCDKgene fromKalanchoedaigremontianafor the first time and the results would be useful for further functional determination of the gene.

Kalanchoedaigremontiana；Cyclin-dependent kinase；Gene expression

2017-04-12

深圳市科技計劃項目(CXZZ20140418110342522)；北京林業大學與廈門日懋城建園林建設股份有限公司產學研合作項目

朱敏群(1978-)，女，江西贛州人，工程師，主要從事園林綠化工作。

鐘天秀(1986-)，女，四川內江人，講師，博士，主要從事草業生物技術研究。

Q78

A

1000-7091(2017)03-0033-09

10.7668/hbnxb.2017.03.006