草地貪夜蛾Sf9細胞對饑餓誘導自噬的響應

謝 昆，王麗仙，王 靖，朱靈明，尹建華，葉青霞，孫 艷

(1.紅河學院 生命科學與技術學院，云南 蒙自 661199；2.云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室，云南 蒙自 661199)

草地貪夜蛾Sf9細胞對饑餓誘導自噬的響應

謝 昆1，2，王麗仙1，王 靖1，朱靈明1，尹建華1，葉青霞1，孫 艷1

(1.紅河學院 生命科學與技術學院，云南 蒙自 661199；2.云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室，云南 蒙自 661199)

為研究草地貪夜蛾對饑餓誘導自噬的響應。從草地貪夜蛾EST數據庫中篩選到一段核苷酸序列，設計特異性引物，RT-PCR技術從草地貪夜蛾Sf9細胞中擴增該核苷酸序列，經過生物信息學分析該序列與昆蟲自噬相關基因ATG8同源性最高，命名為SfATG8基因，并構建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8載體轉染Sf9細胞。Sf9細胞經饑餓(PBS)誘導4 h后，Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦顯微鏡檢測細胞對自噬的響應程度。結果表明，經饑餓(PBS)誘導4 h的Sf9細胞中出現SfAtg8-PE的表達，共聚焦顯微鏡檢測到Sf9細胞膜上的自噬小體。以上證據證實饑餓(PBS)能誘導Sf9細胞發生自噬，為深入研究Sf9細胞對自噬的響應奠定了基礎。

草地貪夜蛾；Sf9；饑餓；自噬

細胞自噬被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡(Program cell death Ⅱ，PCDⅡ)，以降解細胞器和細胞大分子組分形成自噬小體為特點，細胞自噬水平的增加通常由諸如饑餓信號和激素信號誘導，而過度水平的自噬可以引起自噬性細胞程序性死亡[1]。昆蟲綱是節肢動物門中最大的一個綱，也是動物界中種類最多的一個綱，以黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster，Dm)為代表的果蠅作為昆蟲綱的一種模式生物被廣泛應用于細胞自噬(Autophagy)的研究[2-10]。草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda，Sf)為鱗翅目類害蟲，對禾本科作物危害巨大，細胞自噬是其變態發育時期的一個重要生理過程，通過自噬調控草地貪夜蛾等有害昆蟲的變態發育過程有重要意義，對控制草地貪夜蛾對作物的危害具有重要作用。

營養信號和生長因子的存在能夠促進 PI3KⅠ-TOR分子通路的活性，抑制細胞發生自噬[11]，輕度饑餓信號則抑制PI3KⅠ-TOR 分子通路的活性，誘導細胞發生低水平自噬，使細胞處于不可逆死亡前的一種早期保護機制[12-13]。當哺乳動物細胞受到的環境脅迫壓力超過一個安全的閾值時，比如過度的饑餓信號，細胞通過 PI3K Ⅲ 與 Atg6 的結合(PI3K Ⅲ-Atg6分子通路)和 Atg8-PE、Atg12-Atg5 兩大泛素系統發生高水平的自噬，大量積累自噬體，使細胞走向不可逆死亡(PCD)[14]。即過度饑餓、生長因子剝奪、氧化脅迫、感染、蛋白積聚體的積累能導致自噬高水平上調，通過抑制mTORC1能觸發高水平自噬的發生[15]。在昆蟲細胞中對自噬的研究主要集中在果蠅和家蠶細胞中，昆蟲細胞的自噬機理與哺乳動物細胞自噬相似，昆蟲的蛻皮和變態發育由20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)激素和保幼激素(Juvenile hormone，JH)協同調控，20E和饑餓信號通過誘導細胞自噬等生理事件來降解細胞內儲存的能量和營養物質為昆蟲變態發育所利用。饑餓能夠通過抑制PI3KⅠ/Akt-Tor途徑誘導變態發育時期果蠅幼蟲組織細胞發生自噬[10，16]。

自噬蛋白質Atg8-PE是自噬體(Autophagosome)形成后唯一存留的自噬蛋白質，可以作為檢測細胞自噬發生程度的直接證據[17-20]，本研究以鱗翅目昆蟲草地貪夜蛾Sf9細胞為研究對象，經饑餓(PBS)誘導4 h后，應用Lyso-Tracker染色自噬溶酶體、BmAtg8多克隆抗體檢測Sf9細胞中SfAtg8-PE的含量變化等證據來評價自噬強度。再根據已報道的家蠶ATG8(BmATG8)、黑腹果蠅ATG8(DmATG8)、斜紋夜蛾ATG8(SlATG8)、棉鈴蟲ATG8(HaATG8)、粉紋夜蛾ATG8(TnATG8)基因序列和草地貪夜蛾EST數據庫(Spodobase)，設計特異性引物，采用RT-PCR技術從Sf9細胞總RNA中擴增SfATG8基因，構建pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8過表達載體轉染Sf9細胞，經饑餓(PBS)誘導4 h后，倒置熒光顯微鏡檢測EGFP-SfAtg8-PE綠色熒光斑點和mCherry-SfAtg8-PE紅色熒光斑點及融合情況，為饑餓誘導Sf9細胞自噬的檢測提供新的依據和方法。

1 材料和方法

1.1 供試細胞

草地貪夜蛾Sf9卵巢細胞來自于華南師范大學鄧會敏老師，于含有5%胎牛血清(Hyclone，SV30087.01，USA)的昆蟲完全培養基SFX(Hyclone，AXL50928，USA)27 ℃細胞培養箱中繼代培養。

1.2SfATG8的RT-PCR擴增

應用TRIzol試劑(Invitrogen，15596-026)提取Sf9卵巢細胞總RNA，進一步采用反轉錄試劑盒合成cDNA(TaKaRa，DRR047A)，根據BmATG8(GenBank accession number：FJ416330.1 )、HaATG8(GenBank accession number：JQ739159)、SlATG8 (GenBank accession number：JX183217)、TnATG8 (GenBank accession number：JX183216)、DmATG8 (GenBank accession number：NM_167245.2)基因ORFs同源性比較，在草地貪夜蛾EST數據庫中搜索到與上述昆蟲ATG8基因核苷酸序列同源性較高的序列(Spodobase：Sf2M09420-5-1)，以該序列ORF區設計特異性引物，以Sf9卵巢細胞cDNA為模板，應用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶(TaKaRa，R010A)PCR擴增SfATG8基因，PCR反應條件如下： 98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃退火30 s，30個循環。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小，膠回收試劑盒回收純化大小正確的核苷酸片段，將回收產物送交上海生工進行序列測定。

1.3SfATG8的生物信息學分析

應用DNAStar生物信息學軟件，將擴增的SfATG8核苷酸序列與EST數據庫中Sf2M09420-5-1核苷酸序列進行同源性比較，分析SfATG8與Sf2M09420-5-1的同源性。繼續對SfATG8核苷酸序列與BmATG8、HaATG8、SlATG8、TnATG8、DmATG8核苷酸序列進行進化樹分析，分析SfATG8的親緣性。

1.4 Lyso-Tracker

Sf9細胞經PBS饑餓誘導4 h后，2 000 r/min離心10 min，先用PBS洗2次，3.7%甲醛處理5 min，再用50 nmol/L Lyso-Tracker DND-99(Life Tech，L7528，美國)于37 ℃染色10 min，染色結束后用PBS清洗3次，在激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，LSM510，德國)最大激發波長577 nm處檢測呈紅色熒光標記的自噬溶酶體。

1.5 過表達載體構建和細胞轉染

應用基因工程手段構建pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8過表達載體，mCherry基因來源于pmCherry-N1載體，EGFP基因來源于pEGFP-N1載體，mCherry和EGFP分別在pIEX-4載體的SacⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/PstⅠ位點插入，SfATG8在SalⅠ/Hind Ⅲ位點插入。應用Effectence Transfection Reagent轉染試劑盒(QIAGEN，301425，德國)將構建的pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8過表達載體轉染Sf9細胞48 h后，再經PBS饑餓誘導4 h，使用倒置熒光顯微鏡(Life Tech，AMF4302，美國)鏡檢誘導的細胞中mCherry紅色熒光斑點和EGFP綠色熒光斑點及融合情況。

1.6 Western Blotting

Sf9細胞經PBS饑餓誘導4 h后，應用蛋白質提取試劑盒(Beyotime Co，P0013D，中國)提取細胞總蛋白，蛋白定量后(Beyotime Co，P0010S，中國)進行SDS-PAGE電泳，每個泳道10 μg總蛋白，電泳結束后將膠上蛋白轉印至PVDF膜(Bio-Rad，162-0177，美國)，然后將膜與含5%脫脂奶粉的家蠶BmAtg8多克隆抗體(1∶1 000)孵育過夜，再經TBST清洗3次，每次10 min，與含5%脫脂奶粉HRP標記的羊抗兔IgG(Beyotime Co，A0208，中國)孵育2 h，經TBST清洗3次，每次10 min，ECL化學發光顯色(Applygen Co，P1010，中國)檢測蛋白分子量大小。

2 結果與分析

2.1SfATG8的RT-PCR擴增

根據核苷酸同源性比對結果，從草地貪夜蛾EST數據庫中篩選到同源性較高的一段核苷酸序列(Sf2M09420-5-1)(圖1)，該序列大小357 bp，進化樹分析表明與SlATG8親緣關系最為接近(圖2)。以該段序列為依據設計特異性引物，RT-PCR擴增結果得到SfATG8大小約為357 bp(圖3)，與EST數據庫中的核苷酸序列(Sf2M09420-5-1)同源性高達98.3%(圖4)。進化樹分析顯示SfATG8基因與SlATG8親緣關系最為接近(圖5)。

圖1 草地貪夜蛾EST數據庫中篩選到的Sf2M09420-5-1核苷酸序列

圖2 Sf2M09420-5-1核苷酸序列與其他昆蟲ATG8核苷酸序列進化樹分析

圖3 SfATG8的RT-PCR擴增

2.2 Lyso-Tracker

Lyso-Tracker染色檢測細胞自噬溶酶體來評價自噬程度的方法已廣泛應用于昆蟲細胞[5]。Sf9細胞經PBS饑餓誘導4 h后，Lyso-Tracker染色結果表明細胞中自噬溶酶體數量明顯比對照組多，說明PBS饑餓能誘導Sf9細胞自噬(圖6)。

2.3 SfAtg8-PE的Western Blotting檢測

Atg8-PE(哺乳動物LC3-Ⅱ同源物)蛋白含量的高低已被用于評價自噬程度強弱最為直接的證據[18]。Sf9細胞經PBS饑餓誘導4 h后，提取細胞總蛋白，以兔抗BmAtg8多克隆抗體為一抗，經Western Blotting檢測發現PBS饑餓誘導4 h后的Sf9細胞自噬程度增強(圖7)。

圖4 SfATG8核苷酸序列與Sf2M09420-5-1核苷酸序列同源性比較

圖5 SfATG8核苷酸序列與其他昆蟲ATG8核苷酸序列進化樹分析

圖6 饑餓誘導Sf9細胞的Lyso-Tracker染色檢測

圖7 SfAtg8-PE的Western Blotting檢測

2.4 過表達載體構建和細胞轉染

分別以pmCherry-N1和pEGFP-N1質粒為模板，設計特異性引物PCR擴增mCherry和EGFP基因(圖8，9)，與SfATG8構建pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8過表達載體，分別經PCR和雙酶切鑒定正確后將無內毒素重組質粒轉染Sf9細胞，經PBS饑餓誘導4 h后，倒置熒光顯微鏡檢測自噬體膜上的熒光斑點，結果表明，處理組紅色熒光斑點和綠色熒光斑點明顯多于對照組(圖10)，說明處理組自噬程度強于對照組。

圖8 mCherry基因的PCR擴增

圖9 EGFP基因的PCR擴增

圖10 倒置熒光顯微鏡檢測自噬體膜上的熒光斑點

3 討論

3.1SfATG8基因與其他昆蟲ATG8基因高度同源

克隆的SfATG8基因與其他昆蟲ATG8基因同源性比較后發現，SfATG8基因與其他昆蟲ATG8基因具有較高的同源性，特別是與鱗翅目昆蟲ATG8基因同源性極高，與SlATG8同源性達到98.3%。

3.2 PBS饑餓能誘導Sf9細胞對自噬的響應

參照PBS饑餓誘導家蠶Bm-12細胞響應自噬的時間點，選擇PBS饑餓誘導Sf9細胞4 h作為檢測自噬的時間點。以自噬檢測指南中的檢測方法為標準[17]，采用Lyso-Tracker染色、SfAtg8-PE的Western Blotting檢測、mCherry-SfAtg8-PE和EGFP-SfAtg8-PE的倒置熒光顯微鏡檢測自噬小體等方法檢測Sf9細胞對自噬的響應，結果表明，3種方法均能檢測到Sf9細胞對自噬的應答。而且通過Western Blotting方法，應用自制的兔抗BmAtg8多克隆抗體能檢測到Sf9細胞中的SfAtg8蛋白，證明BmAtg8多克隆抗體能夠用于檢測PBS饑餓誘導Sf9細胞自噬。

本研究通過生物信息學分析，利用RT-PCR技術從Sf9卵巢細胞中成功克隆出SfATG8基因；應用Lyso-Tracker染色、SfAtg8-PE的Western Blotting檢測、mCherry-SfAtg8-PE和EGFP-SfAtg8-PE的倒置熒光顯微鏡檢測自噬小體等方法能檢測到草地貪夜蛾Sf9細胞對饑餓誘導自噬的響應情況。

[1] Otomo G，Metlagel Z，Takaesu G，et al.Structure of the human ATG12-ATG5 conjugate required for LC3 lipidation in autophagy[J].Nature Structural & Molecular Biology，2013，20(1)：59-67.

[2] Chang Yu，Neufeld T.Autophagy takes flight inDrosophila[J].FEBS Letters，2010，584(7)：1342-1349.

[3] Liu Kai，Xia Yu，Zhou J，et al.Molecular characterization of autophagy-related gene 5 fromSpodopteraexiguaand expression analysis under various stress conditions[J].Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2016，92(4)：225-241.

[4] Delanoue R，Slaidina M，Léopold P.The steroid hormone ecdysone controls systemic growth by repressing dMyc function inDrosophilafat cells[J].Developmental Cell，2010，18(6)：1012-1021.

[5] Tian L，Ma L，Guo E，et al.20-hydroxyecdysone up regulatesAtggenes to induce autophagy in the Bombyx fat body[J].Autophagy，2013，9(8)：1172-1187.

[6] Wei W，Gai Z，Ai H，et al.Baculovirusinfection triggers a shift from amino acid starvation-induced autophagy to apoptosis[J].PLoS One，2012，7(5)：e37457.

[7] Gai Z，Zhang X，Islam M，et al.Characterization of Atg8 in lepidopteran insect cells[J].Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2013，84(2)：57-77.

[8] Guo E，He Q，Liu S，et al.Met is required for the maximal action of 20-hydroxyecdysone during Bomby×Metamorphosis[J].PLoS One，2012，7(12)：e53256.

[9] Tracy K，Baehrecke E.The role of autophagy inDrosophilametamorphosis[J].Current Topics in Developmental Biology，2013，103(103)：101-125.

[10] Wang Chuan，Zheng Wei，Liu Peng，et al.The steroid hormone 20-hydroxyecdysone upregulated the protein phosphatase 6 for the programmed cell death in the insect midgut[J].Amino Acids，2012，43(2)：963-971.

[11] Wu F，Li Y，Wang F，et al.Differential function of the two Atg4 homologues in the aggrephagy pathway inCaenorhabditiselegans[J].The Journal of Biological Chemistry，2012，287(35)：29457-29467.

[12] Wirawan E，Berghe T V，Lippens S，et al.Autophagy：for better or for worse[J].Cell Research，2012，22(1)：43-61.

[13] Yang Zhifen，Klionsky D J.Eaten alive：a history of macroautophagy[J].Nature Cell Biology，2010，12(9)：814-822.

[14] Maiuri M C，Zalckvar E，Kimchi A，et al.Self-eating and self-killing：crosstalk between autophagy and apoptosis[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2007，8(9)：741-752.

[15] Yu L，Mcphee C K，Zheng L，et al.Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR[J].Nature，2010，465(730)：942-946.

[16] Riddiford L，Cherbas P，Truman J.Ecdysone receptors and their biological actions[J].Vitamins and Hormones，2000，60(1)：1-73.

[17] Klionsky D J，Abdalla F C，Abeliovich H，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J].Autophagy，2012，8(4)：445-544.

[18] Yu L，Mcphee C，Zheng L，et al.Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR[J].Nature，2010，465(730)：942-946.

[19] Yuan Hai，Russell R，Guan Kun.Regulation of PIK3C3/VPS34 complexes by MTOR in nutrient stress-induced autophagy[J].Autophagy，2013，9(12)：1983-1995.

[20] Zalckvar E，Berissi H，Mizrachy L，et al.DAP-kinase-mediated phosphorylation on the BH3 domain of beclin 1 promotes dissociation of beclin 1 from Bcl-XL and induction of autophagy[J].EMBO Reports，2009，10(3)：285-292.

The Response ofSpodopterafrugiperdaSf 9 Cells to Starvation Induced Autophagy

XIE Kun1，2，WANG Lixian1，WANG Jing1，ZHU Lingming1，YIN Jianhua1，YE Qingxia1，SUN Yan1

(1.College of Life Science and Technology，Honghe University，Mengzi 661199，China；2.Key Laboratory of Crops with High Quality and Efficient Cultivation and Security Control，Yunnan Higher Education Institutions，Mengzi 661199，China)

In order to research the response ofSpodopterafrugiperdato starvation induced autophagy， a nucleotide sequences were screened from theSpodopterafrugiperdaEST database， then a pair of specific primers were designed， followed the nucleotide sequences were amplified by RT-PCR technique fromSpodopterafrugiperdaSf9 cells. The bioinformatics analysis showed the nucleotide sequences were high homology with insect autophagy related geneATG8， therefore designed asSfATG8， then constructed the pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8 recombinant vector and transfected into Sf9 cells. After 4 h induction by starvation (PBS)， Lyso-Tracker staining， Western Blotting， confocal microscope experiments detected autophagic response. The results showed that successfully expression of SfAtg8-PE in Sf9 cells after 4 h inducing by starvation (PBS)， and the autophagosomes could be detected by confocal microscope. These evidences confirmed starvation (PBS) could induce autophagy in Sf9 cells and constructed the foundation for the deeply research the response of Sf9 cells to starvation induced autophagy.

Spodopterafrugiperda；Sf9；Starvation；Autophagy

2017-04-19

紅河學院大學生創新創業訓練計劃項目(DCXL151016)；紅河學院大學生科技創新項目(SZ1520)；紅河學院應用型科學研究項目(XJY15Z07)；紅河學院博士專項(XJ15B13)

謝 昆(1975-)，男，云南富民人，副教授，博士，主要從事動物生物化學與分子生物學研究。

S436；Q78

A

1000-7091(2017)03-0091-05

10.7668/hbnxb.2017.03.014