干旱脅迫下外源油菜素內酯對玉米幼苗光合作用和D1蛋白的調控效應

馬 野，原換換，裴新涌，冉午玲，樊曉聰，鄭博元，毛 俊，楊青華，邵瑞鑫

(1.河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450002；2.河南省農科院 農業經濟與信息研究所，河南 鄭州 450002)

干旱脅迫下外源油菜素內酯對玉米幼苗光合作用和D1蛋白的調控效應

馬 野1，原換換1，裴新涌2，冉午玲1，樊曉聰1，鄭博元1，毛 俊1，楊青華1，邵瑞鑫1

(1.河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450002；2.河南省農科院 農業經濟與信息研究所，河南 鄭州 450002)

為了揭示干旱脅迫下外源油菜素內酯對玉米幼苗光合作用的保護機制，采用溶液培養的方法，以駐玉309為試驗材料，研究外源油菜素內酯(BR)預處理及20% PEG-6000模擬干旱脅迫后玉米幼苗的生長參數、葉綠素含量、光合參數、葉綠素熒光參數及D1蛋白含量的變化。結果表明，與干旱脅迫處理(PEG)相比，BR+PEG處理的玉米苗株高增加45.87%，根長增加20.56%，總干物質積累增加8.01%，葉片相對含水量提高4.50%，葉綠素a含量增加26.32%，光合參數(Pn、Gs、Ci、Tr)分別提高9.57%，38.23%，30.19%，28.12%，光合系統Ⅱ(ΦPSⅡ)活性提高了20.48%，最大光化學效率提高了0.66%，光合系統Ⅱ絕對電子傳遞速率(ETR(Ⅱ)和相對電子傳遞速率rETR(Ⅱ))分別提高20.40%和31.02%；D1蛋白含量增加37.34%(P<0.05)。說明在干旱脅迫條件下葉片噴施BR可以改善玉米幼苗的生長發育，減緩光合系統的損傷，促進D1蛋白質的穩定，從而提高玉米幼苗對干旱脅迫的適應性。

玉米幼苗；干旱脅迫；外源油菜素內脂；光合作用；D1蛋白；調控效應

干旱脅迫是最主要的非生物脅迫之一，嚴重影響植物的生長發育、新陳代謝和經濟產量[1]。干旱主要損傷植株的生理代謝和光合作用[2]，導致植株生長受阻、株高降低、葉面積減少、葉片變黃、根質量下降和根長增加，使葉綠素含量降低、光合作用減弱、細胞膜透性增加[3-4]。光合作用是植物生命活動過程中的重要組成部分，是決定作物產量和品質形成的重要前提，而逆境是光合作用重要的限制因素，尤其是干旱脅迫對光合作用的影響更為頻繁。目前，人們普遍認為葉綠體的光系統Ⅱ(PSⅡ)是干旱對光合系統破壞的原初部位[5]。PSⅡ是一種由30多種蛋白質構成的多亞基蛋白復合體，D1蛋白是其中之一，也是逆境損傷的主要靶位[6-8]。在適宜的生長條件下，PSⅡ的活性是通過不斷快速降解和重新合成D1蛋白來維持的，但這種降解合成的平衡體系往往會被由干旱引起的光抑制打破，從而破壞了光合作用，最終造成生物產量的減少和經濟產量的降低。前人研究表明，病害、鹽、衰老、低溫、水分虧缺、紫外線照射以及重金屬等脅迫條件不僅影響植物的光合作用，還影響植物D1蛋白的表達及其代謝[9-16]。而如何通過調控D1蛋白質的表達來提高植物的抗旱能力成為研究熱點。

玉米苗期是整個生育期間的關鍵，苗全、苗壯、早發是玉米高產的基礎，生產上因干旱造成的玉米缺苗斷壟、苗遲苗弱等現象十分普遍，除了篩選和培育抗旱性強的品種外，生長調節物質的應用被廣泛關注。BR(油菜素甾體類化合物)是在植物界普遍存在的一類生長調節物質，活性較高，類似于動物甾醇類激素。近年來有關BR處理提高作物抗旱能力、抗寒能力、耐熱能力、耐藥能力和抗毒能力的報道較多[17-23]。而有關BR處理如何調控玉米D1蛋白的表達，是否能提高光合系統對干旱脅迫的抗性方面尚未見報道。為此，本試驗采用水分敏感型玉米雜交種，研究外源BR處理對PEG-6000脅迫下玉米D1蛋白的調控效應，旨在探明BR處理提高植物光合系統對干旱適應能力的代謝生理和分子機制，為研發抗旱化學調控技術提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

試驗選用水分敏感型玉米品種駐玉309為試驗材料。玉米種子用0.2% NaClO消毒10 min，蒸餾水沖洗后用蒸餾水浸種24 h，然后在盤中28 ℃發芽3 d，轉入Hoagland 營養液中培養至2葉完全展開后，用0.2 μmol/L的BR進行預處理3 d 后，進行20% PEG-6000模擬干旱脅迫處理3 d，處理期間每天更換營養液。幼苗生長的條件為：晝/夜溫度(27±1)℃/(22±1)℃，光強600 μmol/(m2·s)，濕度(75±5)%，光周期12 h/12 h。在前期試驗的基礎上，試驗設為4 個處理：CK(0 PEG-6000，對照)、PEG(20% PEG-6000)、BR(0.2 μmol/(m2·s) BR)、BR+PEG(0.2 μmol/(m2·s) BR+20% PEG-6000)。干旱脅迫后第3天均選取完全展開的第2葉于液氮中保存，進行生理生化指標和D1 蛋白的測定。

1.2 測定方法

1.2.1 生物量的測定 測定完植株的高度及根長后，將植株的地上部和地下部用剪刀分開，分別用自來水3次沖洗干凈，用蒸餾水清洗一次后用濾紙吸干，用1‰天平稱鮮質量。然后在恒溫烘箱中，110 ℃殺青5 min 后于80 ℃烘干至恒重后稱干質量，每個處理重復9次，最終計算總干質量及葉片相對含水量。

1.2.2 光合氣體交換參數測定 使用LI-6400便攜式光合作用測定系統(LI-COR，American)測定不同處理條件下玉米葉片的Pn(光合速率)、Gs(氣孔導度)、Ci(胞間CO2濃度)、Tr(蒸騰速率)等。

1.2.3 葉綠素熒光參數測定 使用FMS-2脈沖調制式葉綠素熒光儀(Hansatech，UK)測定ETR：光合電子傳遞速率、Fo：初始熒光、Fv：暗適應下最大可變熒光、Fm：最大熒光、Fs：穩態熒光、Fm：光打開時的最大熒光產量等熒光參數，通過這些參數可計算出PS Ⅱ的Fv/Fm：最大光量子效率、ФPS Ⅱ：實際光化學效率、Fv/Fo：PS Ⅱ潛在活性、qP：光化學猝滅系數和NPQ：非光化學猝滅系數等值。測定前葉片暗適應時間為20 min，光化學強度為400 μmol/(m2·s)，飽和閃光強度為8 000 μmol/(m2·s)。

1.2.4 類囊體膜蛋白提取 葉綠體類囊體膜蛋白的提取參照Guo等[24]的方法。將不同處理條件下玉米幼苗分別剪取10 g，在研缽中加入液氮充分研磨成均勻的粉狀，加入A液(蔗糖300 mmol/L，氯化鎂5 mmol/L，乙二胺四乙酸二鈉1 mmol/L，氟化鈉10 mmol/L，HEPES-NaOH 50 mmol/L，pH值7.5)10 mL，在搖床上輕振3 min， 充分混勻后用3層紗布將液體過濾到試管中，分裝到離心管中進行離心，離心設置為3 676 r/min，4 min，將離心后的上清去除，保留沉淀，重新加入2 mL B液(蔗糖 5 mmol/L，氯化鎂5 mmol/L，氟化鈉10 mmol/L，HEPES-NaOH 10 mmol/L，pH值7.5)，再次混合均勻后，在5 198 r/min下離心3 min，去上清，將沉淀懸浮于C液中(蔗糖100 mmol/L，氯化鈉 5 mmol/L，氯化鎂10 mmol/L，氟化鈉10 mmol/L，HEPES-NaOH 10 mmol/L，pH值7.5)，進行下一步的電泳試驗。玉米幼苗的類囊體膜蛋白整個提取過程均在4 ℃避光條件下完成，多余樣品可儲存于-80 ℃冰箱中以備后續使用。

1.2.5 SDS-PAGE和Western Blotting檢測 類囊體膜蛋白的分離主要參考Du等[25]的方法，將類囊體膜蛋白樣品按1∶1(體積比)加入蛋白質裂解液(2%十二烷基硫酸鈉、5% β-硫基乙醇、20%甘油、0.01%溴酚藍、Tris-HCl 0.125 mol/L，pH值6.8)，在水浴鍋中沸騰3 min，冷卻后，在 9 492 r/min下離心5 min，吸取上清液，樣品濃度為10 μg 蛋白 (類囊體膜蛋白濃度用考馬斯亮藍在紫外分光光度儀下測定)，采用15%的分離膠 (pH值8.8) 和5%的濃縮膠 (pH值6.8) 進行蛋白分離。蛋白分離完畢后用考馬斯亮藍R-250染色或將分離得到的蛋白轉移到PVDF膜上與D1蛋白抗體進行雜交，以此來進一步分析D1蛋白(分子質量32 kDa)的變化情況，并進行Western Blotting分析。該Western Blotting檢測中所使用的一抗為 D1 蛋白抗體(由Agrisera公司提供)，二抗為辣根酶標記的山羊抗兔IgG (由中杉金橋公司提供)。

1.3 數據分析

對數據進行方差及相關分析采用SPSS 19.0軟件，多重比較以Duncan氏新復極差法進行，并用 Excel 2003進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗生長的影響

由圖1-A看出，干旱脅迫明顯抑制了玉米幼苗生長，而外源BR處理可以緩解干旱脅迫對玉米幼苗生長的抑制。圖1-B可以看出，BR+PEG處理與PEG處理相比，葉片相對含水量提高4.50%。圖1-C可以看出，干旱脅迫抑制了玉米株高和根系的生長，BR+PEG處理比PEG處理株高增加45.87%(P<0.05)，根長增加20.56%(P<0.05)。圖1-D可以看出，PEG處理比CK的總干物質積累量降低14.32%，BR+PEG處理比PEG處理的總干物質積累量提高8.01%。

A.干旱脅迫3 d及BR處理的表型圖；B.干旱脅迫3 d及BR處理對玉米葉片的相對含水量的影響；C.干旱脅迫3 d及BR處理的玉米株高和根長；D.干旱脅迫3 d及BR處理的地上和地下干物質積累；圖中數據為9次重復的平均值±標準誤。不同字母表示數據差異達5%顯著水平。CK.0 PEG-6000； PEG.20% PEG-6000； BR.0.2 μmol/(m2·s) BR； BR+PEG.0.2 μmol/(m2·s) BR+20% PEG-6000。圖2，5、表1-2同。

A.The picture of Brassinosteroids treatment on maize seedlings after 3 d drought stress；B. Effects of Brassinosteroids treatment on relative water content of maize seedlings 3 d after drought stress; C.Effects of Brassinosteroids treatment on plant height and root length of maize seedlings 3 d after drought stress；D.Effects of Brassionosteroids theatment on shoot and root dry weight of maize seedlings 3 d after drought stress.Data in the Fig.1 are mean ± SE of 9 replicates. Values followed by a different letter are significantly different atP<5%. CK. 0 PEG-6000； PEG.20% PEG-6000； BR.0.2 μmol/(m2·s) BR；BR+PEG.0.2 μmol/(m2·s) BR+20% PEG-6000. The same as Fig.2，5，Tab.1-2.

圖1 干旱脅迫下外源BR對玉米苗期形態特征的影響

Fig.1 Effects of Brassinosteroids treatment on plant parameters of morphological characteristics of maize seedlings after drought stress

2.2 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗葉綠素含量的影響

圖2表明，葉綠素a含量BR處理比CK增加18.50%，BR+PEG處理比PEG處理增加26.32%(P<0.05)。葉綠素b含量BR處理比CK增加1.69%，BR+PEG處理比PEG處理增加1.21%。類胡蘿卜素含量BR處理比CK降低8.19%，BR+PEG處理比PEG處理增加15.03%。說明干旱脅迫下玉米葉片噴施BR預處理后，葉綠素a含量明顯增加，葉綠素b和類胡蘿卜素無顯著變化。

2.3 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗葉片光合參數的影響

由表1可知：PEG處理后玉米幼苗葉片的Pn、Gs、Ci、Tr與CK相比均呈現下降趨勢，分別降低29.84%，28.97%，39.42%，44.30%(P<0.05)。而BR+PEG處理相較于PEG處理在Pn、Gs、Ci、Tr上分別升高9.57%，38.23%，30.19%，28.12%。表明外源BR預處理后能夠減少干旱脅迫對植株光合系統造成的傷害。

圖2 干旱脅迫下外源BR處理對玉米葉片葉綠素含量的影響

Tab.1 Effects of Brassinosteroids treatment on plant photosynthesis parameters of maize seedlings μmol/(m2·s)

處理Treatment凈光合速率Pn氣孔導度Gs胞間CO2濃度Ci蒸騰速率TrCK22.846±0.571b0.177±0.014b213.672±6.268b4.000±0.151bPEG16.029±0.950c0.126±0.010c129.439±6.104d2.228±0.071cBR27.121±0.736a0.294±0.037a240.935±7.127a5.337±0.416aBR+PEG17.562±0.967c0.174±0.011b168.515±10.189c2.854±0.259c

2.4 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗葉綠素熒光參數和相對電子傳遞速率的影響

2.4.1 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗葉綠素熒光參數的影響 由表2可知，光系統Ⅱ(PSⅡ)的活性以BR處理為最優。經干旱脅迫3 d后，絕對光合電子傳遞速率(ETR(Ⅱ))、PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、實際光化學效率(ΦPSⅡ)和光化學猝滅系數(qP)等比CK分別降低34.26%，3.32%，34.30%，28.99%；而非光化學猝滅系數(qN)升高6.25%(P<0.05)；而BR+PEG處理的ETR(Ⅱ)、Fv/Fm、ΦPS Ⅱ、qP等值比PEG處理升高20.40%，0.66%，20.48%，16.73%；光系統Ⅰ(PS Ⅰ)中ΦPS Ⅰ和ETR(Ⅰ)，PEG處理比CK和BR+PEG處理分別降低24.31%，24.18%和8.33%，8.22%；說明干旱脅迫3 d后，損傷了玉米PS Ⅱ和PS Ⅰ二者的活性，從而破壞了光合系統，而噴施BR處理有助于緩解干旱脅迫對PS Ⅱ活性的傷害，使植物光合作用正常進行。

2.4.2 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗相對電子傳遞速率的影響 圖3反映了光系統Ⅱ相對電子傳遞速率隨光強變化的趨勢。4個處理在光強0～200 μmol/(m2·s)迅速增加，到200～300 μmol/(m2·s)光系統Ⅱ相對電子傳遞速率趨向于穩定。玉米幼苗受到干旱脅迫后，相對電子傳遞速率減慢，而BR+PEG處理，在223 μmol/(m2·s)時，rETR比PEG處理增加31.02%，表明施加外源BR可以提高干旱脅迫下光系統Ⅱ相對電子傳遞速率。

表2 干旱脅迫下外源BR對玉米苗期葉綠素熒光參數的影響

注：ΦPSⅠ.PS Ⅰ的實際量子產量(實際光合能力、實際光合效率)；ETR(Ⅰ).PS I的絕對電子傳遞速率；ΦPSⅡ.PS Ⅰ的實際量子產量(實際光合能力、實際光合效率)；ETR(Ⅱ).PSⅡ的絕對電子傳遞速率；Fv/Fm.PSⅡ最大光能轉化效率；qN.非光化學淬滅系數；qP.光化學淬滅系數。

Note：ΦPS Ⅰ. The PS I′s actual quantum yield (actual photosynthetic capacity, the actual photosynthetic efficiency); ETR (Ⅰ) .the PSⅠ′s absolute electron transfer rate; ΦPSⅡ.PS Ⅱ actual quantum yield (actual photosynthetic capacity, the actual photosynthetic efficiency); ETR (Ⅱ) .PS Ⅱ absolute electron transfer rate; Fv/Fm.PS Ⅱ maximum light energy conversion efficiency; qN.Non photochemical quenching coefficient; qP. Photochemical quenching coefficient.

圖3 干旱脅迫下外源BR對玉米苗期葉綠素相對電子傳遞速率的影響

2.5 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗葉片類囊體膜蛋白的影響

從圖4可看出，干旱脅迫3 d后，PEG膜蛋白組分水平出現降低趨勢，條帶較模糊，而BR+PEG處理膜蛋白組分比PEG處理條帶清晰。葉綠體光反應中心Ⅱ核心蛋白D1(分子質量32 kDa)，內周捕光天線色素蛋白復合體CP43和CP47(47，43 kDa)，放氧復合體外周蛋白33，24 kDa處，類囊體膜上的ATP合酶的CFl亞基(55 kDa)等條帶處理間差別明顯。CK與BR處理在葉綠體類囊體膜蛋白各組分含量差異不大；表明外源BR預處理對干旱脅迫下玉米葉綠體類囊體膜蛋白的表達是有利的，可以使其維持在正常水平，還能夠減輕葉綠體類囊體膜蛋白在干旱脅迫下所受到的損害。

圖4 玉米葉綠體類囊體膜蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜

2.6 干旱脅迫下外源BR對玉米幼苗葉綠體D1蛋白含量的影響

從圖5可以看出，BR處理比CK的D1蛋白含量高0.96%；而干旱脅迫3 d后，PEG處理比CK的D1蛋白含量減少了52.40%；BR+PEG處理比PEG處理的 D1蛋白含量增加了37.34%(P<0.05)。說明外源BR處理可以抑制干旱脅迫下玉米葉綠體D1蛋白的降解。

圖5 玉米葉綠體D1蛋白的Western Blotting結果

3 結論與討論

干旱脅迫是影響植物生長和發育最常見的環境脅迫。水分虧缺引起植株氣孔關閉、葉片脫落、細胞壁或質膜組成的改變等，從而引起光合作用和膨壓的下降，導致植株生長減慢，產量下降[21，26-28]。有研究表明，BR處理能顯著促進干旱條件下植株的生長，增加其鮮質量、干質量及產量[29-30]；可有效減緩干旱脅迫后幼苗葉片可溶性蛋白質含量的下降，提高SOD活性，增加脯氨酸和MDA的積累[31]。BR處理浸種后，使高粱的萌發速率和幼苗生長速率都增加，并且提高了幼苗可溶性蛋白和游離脯氨酸的含量[32]。Sairam[33]發現，干旱脅迫處理后油菜素內酯能增加小麥的生物量和產量，主要是通過促使綠葉面積增大、葉綠素含量和可溶性蛋白質的含量增加以及光合能力的提高來實現的。本試驗研究表明，與干旱脅迫處理相比，經過BR預處理后進行干旱脅迫處理的玉米幼苗增高45.87%，根長增加20.56%，總干物質積累增多8.01%，葉片相對含水量提高4.50%，葉綠素a含量增加26.32%(P<0.05)，葉綠素b含量增加1.21%，類胡蘿卜素含量增加15.03%，同時玉米幼苗的凈光合速率(Pn)和光合系統Ⅱ的活性(ΦPSⅡ)分別提高9.57%和20.48%，光合系統Ⅱ絕對電子傳遞速率(ETR(Ⅱ)和相對電子傳遞速率rETR(Ⅱ))分別升高20.40%和31.02%，因此，外源BR處理能提高干旱脅迫下玉米幼苗的光合作用效率，使玉米幼苗的生長維持正常，最終減輕了干旱脅迫對玉米幼苗造成的傷害。

葉綠素以非共價鍵和蛋白質結合在一起，并組成色素蛋白復合體，該復合體普遍包埋于高等植物的類囊體膜中。葉綠素與蛋白質的結合在前者遭到破壞后，勢必會受到影響，并導致光能的吸收和傳遞受阻。沒有外界不良環境條件時，D1蛋白通過不斷地快速降解和重新合成的平衡體系來維持植物PSⅡ的活性，而生長壞境的不良變化往往會引起光抑制效應，此效應會打破這種平衡，因此破壞光合作用，并最終影響生物產量和經濟產量[34-37]。有研究表明，水分匱乏使干旱敏感型和不敏感型大麥D1蛋白含量降低，并加速了光抑制進程的速度[38]。本試驗結果表明，噴施BR處理可提高干旱脅迫下玉米D1蛋白的含量，PEG處理比CK的D1蛋白相對含量減少了52.40%；BR+PEG處理比PEG處理的 D1蛋白相對含量增加了37.34%，且都達到了顯著差異水平。說明噴施適宜濃度的BR處理可以抑制干旱脅迫下玉米葉綠體D1蛋白的降解，但是干旱脅迫下，BR處理對光合作用和D1蛋白影響的具體分子機制還有待深入研究。

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Exogenous BR Alleviates Drought Stress by Regulating Photosynthesis and D1 Protein in Maize Seedlings

MA Ye1，YUAN Huanhuan1，PEI Xinyong2，RAN Wuling1，FAN Xiaocong1，ZHENG Boyuan1，MAO Jun1，YANG Qinghua1，SHAO Ruixin1

(1.College Agronomy,Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China； 2.Institute of Agricultural Economics and Information，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China)

In order to reveal the protective mechanism of exogenous Brassinolide on the photosynthesis of maize seedlings under drought stress，this experiment used the Zhuyu 309 as test materials and adopted the solution culture method，studying the changes of growth parameters，chlorophyll content，photosynthetic parameters，chlorophyll fluorescence parameters and D1 protein content of maize seedlings that used 20% PEG-6000 to simulate drought stress after exogenous Brassinolide (BR) pretreatment. Compared with that of drought stress，the results of corn seedling which after the BR pretreatment showed that its height increased by 45.87%，the root length increased by 20.56%，the total dry matter accumulation increased by 8.01%，the relative water content increased by 4.50%，chlorophyll a content increased by 26.32%，and photosynthetic parameters (Pn，Gs，Ci，Tr) increased by 9.57%，38.23%，30.19% and 28.12% respectively，the activity of photosynthetic system Ⅱ (ΦPSⅡ) increased by 20.48%，and the maximum photochemical efficiency increased by 0.66%. Photosynthetic system Ⅱ absolute electron transport rate (ETR (Ⅱ) and the relative electron transport rate of photosynthetic system Ⅱ(rETR(Ⅱ)) were increased by 20.40% and 31.02% respectively. The content of D1 protein increased by 37.34% (P<0.05). The results showed that BR treatment under drought stress condition could improve the growth and development of maize seedlings，alleviate the damage of photosynthesis system，promote the stability of D1 protein and improve the adaptability of maize seedling to drought stress.

Maize seedlings； Drought stress； Exogenous BR； Photosynthesis； D1 protein； Regulatory effect

2017-04-02

河南省科技創新人才計劃支持項目(114100510019)

馬 野(1991-)，男，河南平頂山人，在讀碩士，主要從事玉米抗旱性研究。

楊青華(1966-)，男，河南商丘人，教授，博士，博士生導師，主要從事作物化控栽培研究。 邵瑞鑫(1982-)，女，河南新鄉人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事玉米生理生態研究。

S513.01

A

1000-7091(2017)03-0118-07

10.7668/hbnxb.2017.03.018