乳腺癌患者PTEN、p—AKT蛋白表達情況變化及相關性

梁法清+何陽君+杜正貴

[摘要] 目的 探討乳腺癌患者蛋白酪氨酸酶基因（PTEN）、磷酸化蛋白激酶（p-AKT）蛋白表達及意義。 方法 選取2014年2月～2016年7月華西醫院收集的乳腺癌組織標本91例，同時選取距腫瘤邊緣大于1 cm正常乳腺組織作為對照，采用免疫組化法檢測PTEN和p-AKT蛋白表達。 結果 乳腺癌組織PTEN表達陽性率明顯低于癌旁組織（P < 0.05），而p-AKT蛋白表達陽性明顯高于癌旁組織（P < 0.05）；腋窩淋巴結轉移患者PTEN蛋白表達陽性率明顯低于無腋窩淋巴結轉移患者（P < 0.05），而p-AKT蛋白表達陽性明顯高于無腋窩淋巴結轉移患者（P < 0.05）。PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達與患者組織分級有關（P < 0.05）；p-AKT蛋白表達與患者TNM分期有關（P < 0.05）；PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達與乳腺癌患者年齡、絕經情況、腫瘤大小、雌激素受體和孕激素受體無相關性（P > 0.05）；乳腺癌患者PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達呈負相關性（r=-0.337，P < 0.05）。 結論 乳腺癌組織PTEN蛋白表達降低，p-AKT蛋白表達升高，且PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達呈負相關，可能在乳腺癌發生、發展中有重要作用。

[關鍵詞] 乳腺癌；蛋白酪氨酸酶基因；磷酸化蛋白激酶；免疫組化法

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（b）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of protein tyrosinase gene （PTEN） and phosphorylated protein kinase （p-AKT） in patients with breast cancer. Methods 91 cases of breast cancer tissues in West China Hospital from February 2014 to July 2016 were selected， and normal breast tissues from the edge of tumor tissues 1 cm were selected as control group， immunohistochemical method was used to detect the expression of PTEN and p-AKT protein. Results The positive rate of PTEN expression in breast cancer tissues was significantly lower than that in adjacent tissues （P < 0.05）， but the p-AKT protein expression was higher than the adjacent tissue （P < 0.05）. The PTEN positive expression rate in patients with axillary lymph node metastasis was significantly lower than that in patients without axillary lymph node metastasis （P < 0.05）， while the positive expression of p-AKT protein was significantly higher than that without axillary lymph node metastases （P < 0.05）. The expression of PTEN protein and p-AKT protein was related to the histological grade （P < 0.05）， the expression of p-AKT protein was related to TNM stage （P < 0.05）， the expression of PTEN protein and p-AKT protein were not correlated with age， menopausal status， tumor size， estrogen receptor and progesterone receptor in patients with breast cancer （P > 0.05）. There was a negative correlation between the expression of PTEN protein and p-AKT protein in breast cancer （r=-0.337， P < 0.05）. Conclusion The expression of PTEN protein is decreased in breast cancer， the expression of p-AKT protein is increased， and the expression of PTEN protein and p-AKT protein are negatively correlated， which may play an important role in the development of breast cancer.

[Key words] Breast cancer； Protein tyrosinase gene； Phosphorylated protein kinase； Immunohistochemistry

乳腺癌是臨床上發病率位居女性前三位的惡性腫瘤，相關研究顯示乳腺癌的發病率可達0.006%以上，且近年來呈現明顯的上升趨勢[1]。臨床上乳腺癌患者容易早期發生淋巴結或者遠處轉移，臨床預后不佳。

腫瘤相關信號通路的激活或者調控機制的異常，可以通過影響到癌細胞的增殖、分化及凋亡等病理生理過程，進而促進乳腺癌的發生、發展。而通過對于相關生物學機制的研究，可以揭示乳腺癌的發病機制，并可以為乳腺癌患者的臨床預后評估等提供潛在的參考指標。Ras/PI3K/Akt信號通路的激活，在乳腺癌的發生過程中發揮了重要的調控作用，而蛋白酪氨酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）蛋白可以通過穩定AKT的表達，進而調控信號通路的激活，穩定細胞增殖或者細胞分化等過程，從而起到平衡的作用[2-4]。本研究選取2014年2月～2016年7月華西醫院（以下簡稱“我院”）收集的乳腺癌組織標本91例，探討了PTEN、磷酸化蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，p-AKT）的表達，并揭示了其與乳腺癌患者臨床病理特征間的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月～2016年7月我院收集的乳腺癌組織標本91例，同時選取距腫瘤邊緣大于1 cm正常乳腺組織作為對照；所有組織均來自女性患者，年齡為30～65歲，中位年齡50歲。納入標準：①均接受乳腺癌根治術或改良根治術，術后均經病理證實；②術前未接受放化療等治療；③患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：①臨床病理資料欠缺；②術前接受放化療等治療；③對照組標本經病理學檢查被腫瘤累及。

1.2 檢測方法

采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3 mm，3%H2O2室溫孵育5 min，采用去離子水沖洗3次，每次3 min，采用濃度為10%牛奶蛋白（1 g蛋白加入100 mL純水）封閉，室溫孵育5 min，加入PTEN和p-AKT抗體（鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司），37℃ 孵育2 h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標記的二抗（兔來源，購自羅氏檢測公司），37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入NBT/BCIP色劑顯色5 min，復染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。PTEN蛋白主要表達于細胞質和細胞膜，p-AKT蛋白主要表達于細胞質和細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒，隨機選取10個高倍鏡計數1000個細胞，陽性細胞比例≥20%為陽性。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗；相關性采用Spearman等級相關分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN和p-AKT蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達

乳腺癌組織PTEN表達陽性率明顯低于癌旁組織（P < 0.05），而p-AKT蛋白表達陽性明顯高于癌旁組織（P < 0.05）。見表1、圖1（封三）。

2.2 PTEN和p-AKT蛋白表達與病理特征關系

腋窩淋巴結轉移患者PTEN蛋白表達陽性率明顯低于無腋窩淋巴結轉移患者（P < 0.05），而p-AKT蛋白表達陽性明顯高于無腋窩淋巴結轉移患者（P < 0.05）；PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達與患者組織分級有關（P < 0.05）；p-AKT蛋白表達與患者TNM分期有關（P < 0.05）；PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達與乳腺癌患者年齡、絕經情況、腫瘤大小、雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）無相關性（P > 0.05）。見表2。

2.3 相關性分析

乳腺癌患者PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達呈負相關性（r=-0.337，P < 0.05），見表3。

3 討論

癌基因的激活、癌相關信號通路相關生物蛋白分子的上調及內分泌激素的紊亂等，均可以促進乳腺癌的發生發展，特別是在年齡大于35歲的育齡期女性人群中，乳腺癌的發病率更高[5-7]。一項臨床回顧性分析研究顯示，乳腺癌的病死率可達35%以上，五年生存率不足30%，中位生存時間不足24個月[8]。而通過對于乳腺癌發病過程中相關腫瘤信號通路分子的研究，可以為早期臨床干預、遠期臨床預后評估及分子靶向治療等提供依據，進而改善患者的遠期生存預后。

Ras/PI3K/Akt信號通路是調控細胞增殖、細胞周期及細胞早期侵襲的重要信息傳遞通路，Ras/PI3K/Akt信號通路的激活可以通過促進細胞快速跨越G0期，增加G2/G1期細胞比例，進而促進癌細胞的分化增殖活性[9-10]；Ras/PI3K/Akt下游信號通路分子p-AKT的表達，可以在其羧基末端的多重巰基結構的三級空間旋轉、糖蛋白配體的結合及磷酸化修飾等方面發揮作用，從而導致癌細胞對于臨近新生血管或者組織的浸潤[11-12]。Ras/PI3K/Akt信號通路及p-AKT蛋白在卵巢癌、甲狀腺癌及肝癌等惡性腫瘤中異常表達，且p-AKT蛋白表達越高，患者的臨床分期越晚，遠期生存指標如中位生存時間越短[13-14]，雖然也有相關研究探討了p-AKT在乳腺癌組織中的異常表達，但相關研究僅僅限于流行病學研究，且缺乏對于P-TEN及p-AKT的相關關系的探討。

本研究發現，乳腺癌組織中的PTEN和p-AKT蛋白的表達與癌旁組織具有明顯的差異，PTEN的表達明顯下降，而p-AKT的表達明顯上升，高于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05），提示二者可能參與到了乳腺癌的發生、發展過程中。PTEN的表達缺失失去了其對于p-AKT的表達調控作用，進而導致乳腺癌細胞侵襲能力增強，促進其對于乳腺導管、小葉等組織的浸潤。有研究通過免疫組化分析乳腺癌組織資料，發現PTEN的表達陽性率不足35%，且p-AKT的表達可較普通對照組織上升25%以上，這與本研究的結論較為一致[15]。PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達與腫瘤大小、ER和PR無相關性，提示性激素受體敏感性或者受體密度等的改變，并不會影響到相關腫瘤生物學分子的表達，同時也表明Ras/PI3K/Akt的表達與性激素受體或者信號通路的相關性不強。在發生了淋巴結轉移的患者中，P-TEN的表達顯著下降，而p-AKT的表達明顯上升，P-TEN的表達陽性率的缺失導致癌細胞其對于淋巴結內皮細胞的侵襲能力增強，增強了其對于腋窩淋巴結或者鎖骨下淋巴結等的轉移風險，而p-AKT的表達上升，可以在誘導內皮生長因子的上調或者激活的同時，促進了癌細胞對于淋巴結間質成分組織細胞的結合能力，進而導致乳腺癌患者淋巴結的跳躍式傳遞風險的增加[16-18]。PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達與患者組織分級有關，從機制上考慮可能與以下原因有關：①PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達的改變，可以影響到Ras/PI3K/Akt信號通路下游核轉錄基因的表達[19-20]，進而通過影響到效應蛋白HCY的表達異常，增強了癌細胞的變形及侵襲能力，促進了病灶組織對于臨近正常組織或者遠處器官如肺部或者腦組織的轉移能力；②PTEN蛋白和p-AKT蛋白的表達異常，加劇了腫瘤細胞對于基底膜等屏障的穿透能力，促進了腫瘤細胞通過導管或者淋巴管轉移。但本研究并未發現P-TEN的表達與TNM分期的關系，考慮到臨床樣本量的選擇偏移、病情嚴重程度的不同等，可能影響到了結論的代表性。

綜上所述，乳腺癌組織PTEN蛋白表達降低，p-AKT蛋白表達升高，且PTEN蛋白和p-AKT蛋白表達呈負相關，可能在乳腺癌發生、發展中有重要作用。

[參考文獻]

[1] Fragni M，Bonini SA，Bettinsoli P，et al. The miR-21/PTEN/Akt signaling pathway is involved in the anti-tumoral effects of zoledronic acid in human breast cancer cell lines [J]. Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol，2016， 389（5）：529-538.

[2] 李惠，孫怡，王露，等. 21基因檢測對乳腺癌預測和預后的意義[J].現代腫瘤醫學，2013，24（10）：2379-2382.

[3] 方茅，翁澤平，關弘，等.三陰性乳腺癌組織DJ-1和PTEN及AR表達與預后相關性分析[J].中華腫瘤防治雜志，2013，32（10）：761-764.

[4] 王愛英，林曉燕，王強修，等.腋窩淋巴結陰性乳腺癌組織中PTEN、p-Akt、P-gp表達及意義[J].山東醫藥，2011， 42（31）：19-21.

[5] 呂剛，施開德，朱際飚，等.79例三陰乳腺癌臨床特點回顧性分析[J].中國醫藥導報，2015，12（6）：35-39.

[6] 楊輝，徐笑紅.靶向VEGF-C的siRNA表達載體對人乳腺癌細胞VEGF-C基因表達的影響[J].中國現代醫生，2015，53（10）：1-4.

[7] 張毅，袁梅，劉薇，等.老中青三年齡段三陰性乳腺癌的病理生物學行為及預后影響因素分析[J].中華普通外科雜志，2014，29（11）：873-875.

[8] 陸國芬，張輝挺，馬德奎，等.我國三陰型乳腺癌臨床病理特征與預后的Meta分析[J].中國醫藥導報，2016，13（35）：96-101.

[9] 郭勇，王永玲，高建芝，等.肥胖乳腺癌患者癌組織中PI3K/Akt信號通路的活性及意義[J].中國普通外科雜志，2013，32（11）：1471-1474.

[10] 林思園，李磊，張利華.阻斷PI3K/Akt信號通路逆轉人乳腺癌細胞株MCF-7/ADR的多藥耐藥[J].實用醫學雜志，2014，24（05）：709-711.

[11] 齊亞莉，趙大力，劉彥軍，等.Akt聯合電離輻射對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡、自噬和增殖的影響[J].吉林大學學報：醫學版，2015，22（1）：1-5.

[12] 隆霜，沈宜，謝瑩珊，等.乳腺癌MDA-MB-231細胞源Exosomes對內皮細胞增殖的影響及MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路的作用[J].解放軍醫學雜志，2012， 37（11）：1054-1058.

[13] 王濤，溫桂海，張桂東，等.miR-21調控PTEN/Akt信號通路抑制肝癌HepG2細胞增殖的實驗研究[J].西部醫學，2016，28（2）：169-172.

[14] Wang L，Hao S，Zhang S，et al. PTEN/PI3K/AKT protein expression is related to clinicopathologic features and prognosis in breast cancer with axillary lymph node metastases [J]. Human Pathol，2016，25（5）：90-93.

[15] 文坤明，曾慶良，肖靜，等. pAkt和P-gp蛋白表達與乳腺癌新輔助化療療效相關性分析[J].中華腫瘤防治雜志，2013，22（17）：1336-1339.

[16] Luo S，Chen J，Mo X. The association of PTEN hypermethylation and breast cancer：a meta-analysis [J]. Onco Targets Ther，2016，9（6）：5643-5650.

[17] She QB，Gruvberger-Saal SK，Maurer M，et al. Integrated molecular pathway analysis informs a synergistic combination therapy targeting PTEN/PI3K and EGFR pathways for basal-like breast cancer [J]. BMC Cancer，2016，16（6）：587-589.

[18] Chiang KC，Hsu SY，Lin SJ，et al. PTEN insufficiency increases breast cancer cell metastasis in vitro and in vivo in a xenograft zebrafish model [J]. Anticancer Res，2016，36（8）：3997-4005.

[19] Siddiqui S，Akhter N，Deo SV，et al. A study on promoter methylation of PTEN in sporadic breast cancer patients from North India [J]. Breast Cancer，2016，23（6）：922-931.

[20] Golmohammadi R，Rakhshani MH，Moslem AR，et al. Prognostic role of PTEN gene expression in breast cancer patients from North-East Iran [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2016，17（9）：4527-4531.

（收稿日期：2017-02-09 本文編輯：李岳澤）