利用正交設計優化茄子的SRAP體系

余扣花+王益奎+莫永誠+甘桂云+李文嘉+龍明華

摘 要：以Solanum melongena 自交系01為試驗材料，利用正交設計L16（45）在5因素4水平上對茄子SRAP反應體系穩定性的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶及模板DNA等外部條件進行了優化試驗，并對所穩定的體系進行驗證。得出最佳的體系的引物的濃度為0.4 mmol/L、dNTPs的濃度為0.2 mmol/L、Mg2+濃度為2.0 mmol/L、模板DNA為40 ng、Taq酶濃度為0.25U/μL。

關鍵詞：茄子 正交設計 SRAP

茄子（Solanum.melongena L.）作為中國重要的蔬菜作物，具有悠久的栽培史，中國擁有豐富的茄子資源[1]。隨著分子標記技術的發展，SRAP標記技術在茄子種質資源上及分子育種方面利用越來越廣泛。Sequence-Related Amplified-Poly- morphism（SRAP）標記在2001年開發出來后，該技術操作簡便、重復性好，易于分離條帶和進行檢測等優點，廣泛應用于茄子遺傳多樣性分析、構建遺傳圖譜、雜種優勢預測等方面[2]。為了更快捷的利用SRAP標記對茄子進行科學研究。本試驗運用正交設計的方法對SRAP反應體系進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用18份茄子及茄亞屬材料包括Solanum melongena系列：自交系01、180、273、航茄1號、138、130、越南砧木、茄崎茄、CQ、25；Solanum integrifolium系列：BH、Z5、Z7、Z2；Solanum indicum s101；Solanum sisymbriifolium s102；Solanum torvum s103；Solanum surattense Burm s104均由廣西農科院蔬菜研究所提供。PCR擴增所使用的Taq聚合酶、dNTPs、Mgcl2購自上海生物工程有限公司，SRAP引物由金開瑞生物科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 茄子基因組DNA的提取

基因組DNA提取采用改良CTAB法[3]。將提取的DNA用紫外分光光度計與1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，OD260/OD280是否在1.8～2.0的區間，瓊脂糖電泳無拖尾和蛋白質殘留，將DNA定量濃度為50 ng/μL，-40℃冰箱保存備用。

1.2.2 SRAP反應體系優化的正交設計

采用L16（45）進行正交試驗設計，對主要影響SRAP反應體系的Mg2+、Taq酶、模板DNA、dNTPs以及引物濃度進行5因素4水平篩選，共16個處理，方案如表1。每個處理設置3次重復。除表中變化因素外，每個反應中添加2 μL 10 × PCR buffer，用ddH2O補足20 μL反應體系。

1.2.3 PCR擴增與電泳檢測

以01基因組DNA作為模板，em3me1為引物進行SRAP反應體系的建立與正交試驗，em3和me1的引物序列分別為5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'。PCR擴增在Applied Biosystems（美國）的4375786擴增儀上進行，選用SRAP-PCR基本的反應程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共5個循環；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴增結束后，加入2 μL10 × Loading buffer，混合均勻后取1.2 μL產物進行7 %聚丙烯酰胺凝膠電泳，穩定電壓220V電泳50 min。電泳結束后用1 %的AgNO3進行銀染10 min，然后在顯影液（12 g/L NaOH、0.2 %甲醛、0.3 g/L硼砂）顯影至金黃色，相機拍照保存結果。

1.2.4 優化體系的驗證

用正交試驗后優化所得的最佳反應體系，對18份茄亞屬單株進行DNA的SRAP擴增，重復3次。

2 結果與分析

2.1 SRAP擴增條帶的直觀分析

按照表1設計對16個處理進行了PCR擴增，見圖1，根據條帶的數量，清晰度，及背景顏色進行打分：條帶豐富，清晰度高，背景顏色淺的打9分，反之，打1分[5]。對3次重復分別進行計分，得分見表1，從結果可以看出，3次結果一致性高，重復性好。假設各因素不存在交互作用的情況下，對3次結果進行直觀分析：計算各因素同一水平對應的K值、平均值k和極差R，結果見表2。

極差R大小反映了各因素對正交體系的影響，R值越大，對體系影響越大；每個因素水平下的k大小反映了各水平對體系的影響情況，k值越大，反應水平越好[6]。由表2 可知，對茄子SRAP正交反應體系影響由大到小依次為：Mg2+>引物>DNA模板>dNTPs>Taq酶。

通過電泳得到茄子SRAP正交反應最佳體系為：Mg2+濃度為2.0 mmol/L，引物濃度為0.4 mmol/L，DNA模板40 ng，dNTPs的濃度為0.2 mmol/L，Taq酶濃度為0.25 U/μl。

2.2 最佳反應體系的驗證

用引物em2me6（5'-GACTGCGTACGAATTT GC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGTAA- 3'）對18份茄亞屬單株DNA用上述最佳SRAP反應體系進行擴增，結果見圖2。結果顯示不僅茄子材料擴增的條帶清晰、多態性好，對茄亞屬材料也能擴增出清晰度高、多態性好的條帶，說明該穩定反應體系廣泛適用于茄亞屬的SRAP擴增。

3 討論

由于PCR-SRAP反應體系是多因素共同作用的反應體系，每個因素的不同水平對SRAP反應結果都會產生影響，最優的反應體系對試驗的后續進行至關重要，關系著整個試驗的成敗[7]。因此，優化茄子SRAP反應體系，更好的利用SRAP分子標記在開展茄子研究工作中奠定基礎。本試驗中，Mg2+濃度對反應體系影響最大，當Mg2+濃度為3.0 mmol/L時，擴增條帶不穩定，條帶數量增多，當Mg2+濃度為1.5 mmol/L時，擴增條帶少，條帶不清晰，此結果與鄒小云[4]研究結果一致。dNTPs濃度在各水平均為顯著差異，當在0.2 mmol/L與0.3 mmol/L水平上整體反應評分較高這與陳書霞[8]和王芳[2]研究結果基本一致。當濃度為0.1 mmol/L時，條帶增多，且相對比較清晰，這與陳書霞研究結果有一定差異，可能是各因素相互影響的原因。引物在各水平上表現出顯著性差異，濃度為0.2 mmol/L時，擴增條帶變少，主要擴增出幾條主帶，當濃度為0.8 mmol/L時，擴增條帶明顯增多。DNA做為反應的模板，濃度升高擴增出的非特異性條帶增多，一般DNA濃度適合范圍較寬，在20～60 ng，均能擴增出清晰條帶。這與何建文[9]和任羽[10]等研究結果基本一致。

優化茄子SRAP反應體系，對更好的利用SRAP分子標記研究茄子遺傳多樣性及分子育種，減輕試驗工作量，提供更高效、準確的方法。本試驗在5個因素4水平共16個處理，優化SRAP體系，得到最佳體系。

參考文獻

[1] 中國農業科學院蔬菜花卉研究所.中國蔬菜栽培學（第二版）[M].北京：中國農業出版社，2010.

[2] 王芳，王嵐，周延清. 利用正交設計優化大豆SRAP-PCR反應體系[J]. 種子，2014 （11）：78-81.

[3] 管志坤. 茄子種質資源遺傳多樣性SSR和SRAP分析[D]. 保定：河北農業大學，2012.

[4] 鄒小云，鄒曉芬， 陳倫林， 等. 花生SRAP-PCR反應體系的正交設計優化[J]. 分子植物育種，2010，8（4）：822-826.

[5] 吳智明，曾晶，胡開林，等. 利用正交設計優化辣椒SRAP反應體系[J]. 北方園藝，2010（11）：152-154.

[6] 桂騰琴，孫敏，喬愛民，等.正交設計優化果梅ISSR反應體系[J]. 果樹學報，2009，26（1）：108- 112.

[7] 應東山，羅海燕，王明，等. 正交優化芒果SRAP擴增體系及引物篩選[J]. 熱帶作物學報，2014（4）：700-705.

[8] 陳書霞，崔鴻文，張延安. 利用正交設計優化辣椒的SRAP反應體系[J]. 西北農業學報，2010，19（4）：184-187.

[9] 何建文，楊文鵬，韓世玉，等. 辣椒SRAP-PCR反應體系主要影響因素的單因素和正交設計優化[J]. 種子，2009（9）：24-28，32.

[10] 任羽，王得元， 張銀東， 等. 辣椒SRAP反應體系的建立與優化[J]. 分子植物育種，2004，2（5） ：689-693.