轉(zhuǎn)錄共刺激因子對結(jié)直腸癌基質(zhì)金屬蛋白酶及相關(guān)蛋白的影響

潘杰　林夢心　林炳鏘　徐宗斌

【摘要】 目的：探討轉(zhuǎn)錄共刺激因子（TAZ）對結(jié)直腸癌基質(zhì)金屬蛋白酶及相關(guān)增殖蛋白的影響，分析其影響結(jié)直腸癌腫瘤生物學(xué)行為的可能作用機制。方法：采用合成TAZ小干擾RNA（TAZ-siRNA）轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞株HCTT116抑制TAZ表達，檢測細胞活性、侵襲遷移能力、細胞凋亡，采用實量定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測TAZ與基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達，采用Western blot法相關(guān)蛋白表達。結(jié)果：轉(zhuǎn)染組TAZ mRNA與蛋白表達均明顯低于對照組與空白組（t=27.116、17.600、24.051、16.168，P<0.01）；HCT116細胞活性、侵襲遷移能力均明顯低于對照組與空白組，細胞凋亡率均明顯高于對照組與空白組（t=12.944、17.613、20.489、12.639、18.324、20.051，P<0.01）；基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等mRNA表達均明顯低于對照組與空白組，金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）mRNA表達均明顯高于對照組與空白組（t=13.588、10.041、6.678、13.164、10.479、6.705，P<0.05或<0.01）；B細胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）蛋白表達均明顯低于對照組與空白組，bcl-2相關(guān)X蛋白（bax）、細胞色素C（Cyt C）表達均明顯高于對照組與空白組（t=9.358、7.670、15.205、19.163、5.937、17.063，P<0.05或<0.01）。結(jié)論：抑制轉(zhuǎn)錄共刺激因子（TAZ）能夠抑制結(jié)直腸癌腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移，可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶、相關(guān)蛋白表達水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌； 轉(zhuǎn)錄共刺激因子； 金屬蛋白酶； 增殖蛋白

Impact of Matrix Metalloprotein and Proliferin of TAZ for Colorectal Cancer/PAN Jie，LIN Meng-xin，LIN Bing-qiang，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：030-033

【Abstract】 Objective：To study the effect of matrix metalloprotein and proliferin of TAZ for colorectal cancer，and analyzed possible mechanisms of colorectal cancer biological behavior.Method：Using TAZ-siRNA transfection colorectal cancer cell line HCTT116 inhibits TAZ expression，and cell activity，attack mobility，apoptosis，TAZ and matrix metal protease mRNA expression，related protein expression were tested.Result：Transfection groups TAZ mRNA and protein expression were significantly lower than those of the control group and the blank group（t=27.116，17.600，24.051，16.168；P<0.01）.HCT116 cell activity，attack mobility ability were significantly lower than those of the control group and the blank group，apoptosis rate was significantly higher than those of the control group and the blank group（t=12.944，17.613，20.489，12.639，18.324，20.051；P<0.01）.MMP-2，MMP-9 mRNA expression were significantly lower than those of the control group and the blank group，TIMP-1 mRNA expression was significantly higher than those of the control group and the blank group（t=13.588，10.041，6.678，13.164，10.479，6.705；P<0.05 or<0.01）.Bcl-2 protein expression was significantly lower than those of the control group and the blank group，bax，Cyt C expression were significantly higher than those of the control group and the blank group（t=9.358，7.670，15.205，19.163，5.937，17.063；P<0.05 or <0.01）.Conclusion：TAZ can inhibit tumor cell proliferation and metastasis of colorectal cancer，it may be related to regulating the substrate metal protease and related protein expression levels.

【Key words】 Colorectal cancer； TAZ； Matrix metalloprotein； Proliferin

First-authors address：Fujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou 350000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.008

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）位居腫瘤相關(guān)死亡的第3位，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，盡管西妥昔單抗等靶向藥物不斷應(yīng)用于臨床，但5年生存率仍不足70%[1]。結(jié)直腸癌發(fā)病機制尚未完全清楚，近期研究表明，具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共刺激因子（transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ）具有原癌基因特征，能促進腫瘤細胞侵襲、導(dǎo)致細胞癌變[2-3]，在結(jié)直腸癌組織中呈異常高表達現(xiàn)象[4]。有關(guān)TAZ對結(jié)直腸癌腫瘤生物學(xué)行為影響的文獻報道較少，本文通過抑制結(jié)直腸癌HCT116細胞TAZ表達的方法，分析TAZ對結(jié)直腸癌基質(zhì)金屬蛋白酶及相關(guān)蛋白表達的影響，旨在分析其結(jié)直腸癌腫瘤生物學(xué)行為影響的可能作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)直腸癌HCT116細胞株：福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒：美國Promga公司；Trizol Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑：美國Invitrogen公司；PCR引物與小干擾RNA：武漢博士德生物工程有限公司；蛋白提取試劑盒：廣州健侖生物科技有限公司；凋亡染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；細胞計數(shù)檢測試劑盒：日本Dojindo公司；TAZ、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）、bcl-2相關(guān)X蛋白（bax）、細胞色素C（Cyt C）：美國Santa Cruz公司。癌組織標本選擇2015年7-12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除結(jié)直腸癌患者20例，術(shù)前均未行放化療。

1.2 細胞培養(yǎng)與TAZ小干擾RNA（TAZ-siRNA）轉(zhuǎn)染 常規(guī)將HCT116細胞株置入DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 mg/mL鏈霉素）培養(yǎng)。siRNA濃度調(diào)節(jié)為80 nmol/L，將細胞密度2×105/mL的HCT116細胞接種到6孔板培養(yǎng)24 h，參照說明書混合靜置轉(zhuǎn)染24 h觀察轉(zhuǎn)染效果。siRNA序列：TAZ：5-GCCACAUCUGGAACCUGAAGUUGAU-3；對照：5-GACGAGTTGACTGCGATTG3。

1.3 細胞活性 采用CCK-8法檢測，將2×105/mL

密度HCT116細胞接種到96孔板，生長至60%～80%時轉(zhuǎn)染siRNA，置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）培養(yǎng)48 h后，加10 μL的CCK-8孵育2 h。采用全波段酶標儀（450 nm處）測定吸光度，連續(xù)3次。

1.4 細胞侵襲遷移能力 參照王紅鈺等[5]文獻資料，采用細胞劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗測量細胞侵襲遷移能力。

1.5 細胞凋亡率 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，調(diào)整細胞密度為5×105/mL，使用結(jié)合緩沖液（500 μL）懸浮細胞，加入10 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和10 μL碘化丙錠混勻，孵育15 min，采用流式細胞法（FCM）測定細胞計數(shù)。

1.6 TAZ與基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達 轉(zhuǎn)錄48 h后提取細胞總RNA，取2 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后于RT-qPCR儀中進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min→95 ℃變性30 s→72 ℃退火30 s，共進行45個循環(huán)。通過PCR反應(yīng)曲線獲取閾值循環(huán)數(shù)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，計算相關(guān)基因表達量。各引物序列。

轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，加入一抗、二抗孵育，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用增強型化學(xué)發(fā)光試劑法檢測蛋白水平變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用方差分析或t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAZ mRNA與TAZ蛋白表達 轉(zhuǎn)染組TAZ mRNA與蛋白表達均明顯低于對照組與空白組（P<0.01），對照組與空白組TAZ mRNA與蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見

2.2 TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染對HCT116細胞活性、侵襲、凋亡的影響 轉(zhuǎn)染組HCT116細胞活性、侵襲遷移能力明顯均低于對照組與空白組，細胞凋亡率明顯高于對照組與空白組（P<0.01）。對照組與空白組細胞活性、細胞侵襲遷移能力、細胞凋亡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染對bcl-2等相關(guān)蛋白表達的影響 轉(zhuǎn)染組bcl-2蛋白表達明顯低于對照組與空白組，bax、Cyt C表達均明顯高于對照組與空白組（P<0.05或<0.01）；對照組與空白組bcl-2、bax、Cyt C等表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

Hippo信號通路是一條高度保守的細胞生長抑制性信號通路，作為Hippo通路的主要效應(yīng)分子，TAZ在組織細胞分化、發(fā)育及生長中具有重要作用[6-7]。相關(guān)研究表明，TAZ在乳腺癌細胞中過表達約20%，其表達水平與腫瘤的侵襲能力密切相關(guān)[8-9]；在MCF7、Hs578T細胞中，沉默TAZ的表達可以顯著降低腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[10-11]；在裸鼠成瘤中，抑制TAZ的表達同樣明顯降低了乳腺腫瘤細胞的成瘤率[12]。曾長青等[13]研究報道，TAZ在結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織表達明顯高于癌旁組織，且與TNM分期、腫瘤大小、浸潤深度明顯相關(guān)，認為TAZ是一個潛在的結(jié)腸癌治療靶點。

RNA干擾是雙鏈RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，可有效降解靶基因mRNA，是研究腫瘤治療與基因功能的有效方法[14]。本研究中，采用RNA干擾技術(shù)抑制結(jié)直腸癌HCT116細胞株中TAZ的mRNA與蛋白表達，結(jié)果表明，TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞活性、侵襲遷移能力均明顯低于對照組與空白組（P<0.05），細胞凋亡率明顯高于對照組與空白對照組（P<0.05）。提示抑郁結(jié)直腸癌TAZ表達水平可降低腫瘤細胞活性，促進細胞細胞凋亡，王紅鈺等[15]也有類似的文獻報道。

相關(guān)研究表明，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，其中腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)侵襲能力發(fā)揮著重要的作用[16]，文獻[17-18]報道結(jié)直腸浸潤邊緣發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9、TIMP-1，其中MMP-2、MMP-9能夠促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，TIMP-1可抑制腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[17-18]。

本研究中，抑制結(jié)直腸癌TAZ表達水平后，

TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9等mRNA表達均明顯降低，TIMP-1 mRNA表達明顯升高，提示抑制結(jié)直腸癌TAZ表達水平能夠抑制腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移。bcl-2、bax Cyt C均是調(diào)節(jié)細胞增殖凋亡的重要蛋白[19-20]，這也可以從三組bcl-2、bax Cyt C蛋白表達水平比較中得到證實。

綜上所述，抑制結(jié)直腸癌TAZ表達水平有助于抑制結(jié)直腸癌腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶與相關(guān)蛋白細胞表達水平等因素有關(guān)，其具體作用機制尚待于進一步研究。

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（收稿日期：2017-05-10） （本文編輯：程旭然）