國內花卉花香基因研究進展

毛立彥+韋勇杰+覃茜+賓振鈞+龍凌云+謝振興+郝小玲+於艷萍

摘 要：花香是花卉“形、色、香”三要素之一，是評價花卉品質的重要依據，并有可能在花卉植物的抗逆性中起著關鍵作用。近20年來，國內對花香的研究大多集中于花香成分分析，對于花香基因研究起步晚，文章綜述了國內在花香基因克隆、分離及轉基因方面的研究進展，同時展望了我國今后花香基因的研究方向。

關鍵詞：花香 基因 克隆 基因分離 轉基因

花香是由植物散發的一系列低分子量揮發物所致，不同花卉植物散發出的揮發物種類，含量不同，比例不同都會導致最終形成的香味也不同。因此，不同花卉植物往往具有自己的獨特香味。花香對于植物繁衍和生長過程起著重要作用，通過花香可以吸引昆蟲幫助其授粉，也可以吸引食草動物的天敵，從而減少對自己的傷害。另外花香也是植物應激反應的重要信號物質[1]。從花香植物中提取香精、香料作為化妝品和輕工業的原料是國內外關注的重要問題。影響花香的因素主要有植物基因型，花的發育階段、植物開花時一系列激素水平及環境因素，其中植物基因型是花香化合物種類、含量的決定因素[2]。國內對于花香基因的研究剛剛起步，主要集中于花香相關基因克隆、花香基因工程等方面。本文根據國內文獻資料對國內花香基因研究進展進行了簡要概述，旨在為花卉花香的理論研究提供參考。

1 花香化合物種類及相關基因

花香化合物主要包含3類揮發性物質即脂肪酸衍生物，萜類化合物和苯丙酸類化合物/苯環型化合物，其中脂肪酸衍生物起源于丙二酸途徑，萜類化合物主要包括單萜和倍半萜，起源于甲羥戊酸途徑，苯丙酸類化合物/苯環型化合物起源于莽草酸途徑[3]根據花香物質的合成途徑，研究者們在仙女扇、煙草、月季、矮千牛、金魚草等模式植物中篩選出13個香味化合物合成關鍵酶的基因，詳見表1。

隨著分子生物學研究的深入和進步，在幾種模式植物的基礎上研究者們不斷采用多種分子生物學手段從其它花卉植物中分離、克隆相關花香基因，并對其表達進行了研究。

2 花香基因分離、克隆和表達分析

由于花香是花卉植物的三要素之一，因此運用基因工程手段對無香味花卉進行花香花卉優選育種是提高花卉品質的重要手段。對于花香基因的轉基因研究要先從花香基因的分離、克隆開始。國內相對于國外花香基因工程研究起步晚，現在大多集中于此階段。其中在模式植物矮千牛上，張海英克隆出了花香基因BSMT3，并對其序列進行了生物信息學分析和原核表達研究[4]，肖志娜從矮千牛花瓣中篩選出了控制乙烯傳導途徑的ERF因子，最終得出phERF6，phERF25，phERF30均能抑制花香基因的表達[5]。陳陳采用RACE手段獲得了玫瑰單萜類花香化合物合成相關基因RrDXR和RrAAT基因，并對其在玫瑰不同發育時期和花器官不同部位進行了時空表達規律研究[6]，在接下來的兩年中分別從玫瑰中克隆出了與單萜類合成相關的RrLIS基因[7]和與2-苯丙醇生物合成相關的RrAADC，RrPAR基因，并對其在花中的時空表達進行了分析[8]，陳功對玫瑰進行鹽脅迫研究發現，雖然鹽脅迫條件下花香基因RrDXR、RrDXS2和RrAAT的表達上調，但由于這些基因對于植物的逆境應激反應相關，并未引起花香物質的增多和花香味的加濃[9]。通過對幾種模式花卉植物的花香物質合成酶基因的分離克隆進一步加強了我國在花香基因利用方面的研究。

經過多年努力，隨著國際花香基因研究突破，我國花香基因分離、克隆研究起點高，很快突破到了除模式花卉植物的其他物種，如蘭花、桂花、百合、梅花、蠟梅等。在蘭花花香基因研究中，2006年王健等用RAPD分子標記技術分離出跟春蘭相關的香味基因片段[10]。樊榮輝在小蒼蘭中分離出了LIS基因，并對其進行了生物信息學分析和在花朵中的時空表達研究[11]，周銀在蕙蘭中分離出控制花香合成的基因CfAOC，并對其基因結構和亞細胞定位進行了分析[12]。

在桂花花香研究中，張園利用cDNA-AFLP技術從桂花中分離出6個可能與其香味物質合成途徑相關的酶，其中AACT、CCD4為兩個萜類化合物基因，2OGox2，CFAT和C4H1為三個苯丙烷類化合物代謝途徑相關酶基因，LOX為脂肪酸衍生物合成途徑相關酶，但其全長有待進一步研究[13]。陳蓉[14]與鄭玉娟[15]分別從四季桂和月月桂中分別克隆出GES、ADH和AACT基因全長，并對其在花中的時空表達進行了分析，陳麗莉在四季桂花瓣中分離出DXPS基因，并研究了其時空表達[16]，以上為我國桂花香氣的利用奠定了基礎。

在百合上研究者們分別先后克隆出花香物質合成酶基因LrBSMT、LiLis[17]、LiMys[18]、LIFPPS[19]和調控基因LoCOP1和LoSPA[20]，為百合花香基因合成和調控機理研究奠定了基礎。

在水仙研究中研究者先后利用RACE和抑制削減雜交文庫等分子生物學手段從水仙中分離出控制萜類化合物合成的DXPS、DXR[21]和HMGS[22]基因及控制苯丙氨酸代謝的SAMT[23]基因，這些基因的成功分離為下一步研究花香調控機理及花香基因工程研究都具重要意義。

在夜來香的花香基因研究中，花香基因科研工作者先后采用RT-PCR和RACE結合技術分離出于花香物質合成相關的轉錄因子：NAC、MYB和GCS[24]及花香不同花香代謝途徑的關鍵酶基因LIS和FPPS[25]和SAMT[26]，為夜來香花香基因的轉基因育種技術提供了材料。

作為我國名花的蠟梅，擁有怡人芬芳，經研究表明其主要花香成分為萜類和苯環類揮發物，通過RT-PCR和RACE聯合技術從蠟梅中分離出SAMT和FPPS兩個基因，并利用原核表達技術驗證了其功能，實時定量辦法測定了其在花中的時空表達[27]。在此基礎上，葉蕾[28]克隆得到了兩個可能與蠟梅花香調控相關的轉錄因子：CpODO1，CpODO2，并對其進行進行了時空表達分析，陳金豆進一步探究了CpODORANT1 和 Cp ODORANT2基因的功能，證明其確實與花香物質表達量相關[29]。此外，在四大君子之一的梅花上，研究者們先通過生物信息學手段對于丁子香酚基因相關的基因PmOMT基因的結構[30]，進一步成功分離出3個丁子香酚合酶基因即PmEGS1、PmEGS2、PmEGS3，并測定了其在花中的時空表達[31]。

茉莉花是我國江浙一帶的食賞兩用型多功能花卉，其香氣濃郁，是著名的花茶原料。為了解茉莉花的香氣形成機理，科研工作者們先后從其花瓣中克隆分離出FPPS、DXS、HMGR、PAL、SAMT基因，并獲得其全長，運用熒光定量法分析其在花中的時空表達[32]，張芊在此基礎上進一步采用cDNA-AFLP技術分析得到85個可能與萜類和苯類/苯丙素類物質代謝相關基因，進一步篩選出確定與茉莉花香氣相關的6條基因[33]，以上對我國促進茉莉花香氣機理研究明確了方向。

此外，張雪榮成功克隆出薰衣草中的芳樟醇合成酶基因全長，并對該基因進行了在煙草中的轉基因研究，最終在煙草中檢測到了該基因的表達[34]。郭鳳芝在玳玳華克隆出了跟脂氧化相關的酶基因HPL，該基因合成的酶催化花卉植物特異性氣味物質的合成[35]，高耀輝在神農香菊中克隆出DiaMYB基因[36]，張騰旬比較了百合、百里香等四種植物的TPS的結構[37]，這些花香基因的分離、表達分析都為我國花香基因研究做出了貢獻。

3 花香轉基因研究

利用花香基因進行花卉植物的定向育種中一個不可避免的步驟即進行花香基因的轉基因，并檢測其表達。我國在這方面的研究雖然少，但也有相關文獻報道，龐宏東等將蠟梅的SAMT基因分別轉入煙草[38]和矮千牛[39]中，最終檢測有部分的香味揮發物質的增高，陳蓉將桂花的ADH基因成功轉入了紅檵木中并最終檢測篩選出了轉基因植株，但并未對其香味物質進行檢測[14]，葉蕾將蠟梅的花香相關基因轉錄因子轉入擬南芥和煙草中，最終篩選出10株成功轉入的植株[28]，王佳將玫瑰的花香物質合成基因成功轉入了矮千牛中，并誘導出了愈傷組織[40]，張雪榮將薰衣草的芳樟醇合酶基因成功轉入了煙草[34]，鄭鴻昌將夜來香的3個花香相關基因轉入煙草，最終篩選出了轉基因植株[24]。

4 我國花香基因研究展望

經過多年的努力，我國在高起點的花香基因研究中取得了豐碩的成果，初步得到了多種植物花香產物代謝途徑的相關酶基因，但目前我國國內的花香基因研究多數集中在基因分離、克隆、表達分析及功能驗證方面，在轉基因導入及基因調控手段方面研究較少，因此在今后的研究中，應不斷加強花香基因克隆分析，了解花香形成分子機制的同時開展已有花香基因的轉基因研究，力爭對不具備花香的花卉植物進行花香基因轉入產生花香，定向育成多種花香、色美、形優的優良花卉品系，將我國的花卉育種事業提高到新的高度。

參考文獻

[1] 向林， 陳龍清. 花香的基因工程研究進展[J]. 中國農業科學，2009，42（6）：2076-2084.

[2] 李瑩瑩. 花香揮發物的主要成分及其影響因素[J]. 北方園藝， 2012（6）：184-187.

[3] 程金水， 劉青林. 園林植物遺傳育種學第2版[M]. 北京： 中國林業出版社：89-90.

[4] 張海英. 矮千牛花香基因BSMT3 cDNA克隆與原核表達[D].四川： 四川大學， 2007.

[5] 肖志娜. 矮千牛花香相關的ERF篩選及其調節機理初探[D].廣州：華南農業大學，2016.

[6] 陳陳. 玫瑰花香成分生物合成相關基因的克隆與表達分析[D].揚州：揚州大學，2012.

[7] 李婷琳. 玫瑰單萜代謝相關基因RrDXS和RrLIS的克隆與表達分析[D].揚州：揚州大學，2013.

[8] 王猛. 玫瑰2-苯乙醇生物合成相關基因的克隆與表達分析[D].揚州：揚州大學，2014.

[9] 陳功. 鹽脅迫對玫塊精油香氣成分、含量及相關基因表達的影響[D].揚州：揚州大學，2015.

[10] 王健， 樂超銀， 謝偉， 等. 蘭花香味相關基因的RAPD分子標記[J]. 江蘇農業科學， 2006 （5）： 78-79.

[11] 樊榮輝， 黃敏玲， 鐘淮欽，等. 小蒼蘭芳樟醇合酶基因的克隆及表達分析[J]. 中國細胞生物學學報，2016， 38（10）： 1185–1190.

[12] 周銀， 王松太， 董坤，等. 蕙蘭CfAOC基因的克隆及表達分析[J]. 北方園藝，2015（14）：84- 89.

[13] 張園. cDNA-AFLP技術分離桂花香氣相關基因[D]. 福州：福建農林大學，2009.

[14] 陳蓉. 桂花香氣基因GES和ADH的cDNA克隆和紅檵木轉化研究[D]. 長沙：中南林業大學，2015.

[15] 鄭玉娟. 月月桂香精油提取研究及其調控基因AACT克隆技術[D]. 長沙：中南林業大學，2015.

[16] 陳麗莉， 陳容， 覃杰明， 等. 桂花香氣相關基因DXPS 基因克隆及表達分析[J]. 分子植物育種，2015，13（11）：2500-2509.

[17] 王歡， 李路路， 解雪華， 等. 岷江百合花香基因的克隆與表達分析[J]. 中國觀賞園藝研究進展，2014：217-224.

[18] 唐彪， 胡增輝， 冷平生， 等. 濃香型和淡香型百合單萜合酶基因差異表達[J]. 北京農學院學報，2016，31（2）：88-94.

[19] 唐艷萍. 百合的再生體系建立與FPPS基因的克隆[D]. 武漢：華中農業大學，2011.

[20] 劉洋. 百合COP1和SPA對光的響應及在花香形成中的作用[D]. 廣州：華南農業大學，2016.

[21] 馬傳營. 中國水仙花香相關基因DXPS、DXR和PAL的克隆[D]. 福州：福建農林大學，2010.

[22] 李科. 多花水仙花香成分分析和相關基因的克隆[D]. 福州：福建農林大學，2014.

[23] 鄭清波. 中國水仙NtSAMT基因的克隆及轉化金魚藤的研究[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2016.

[24] 鄭鴻昌. 夜來香均一化全長cDNA文庫的構建與花香相關基因的遺傳轉化[D]. 福州：福建農林大學，2012.

[25] 呂恃衡. 夜來香生物鐘及花香基因的克隆[D].福州：福建農林大學，2013.

[26] 楊華麗， 呂恃衡， 蔡韡韡， 等. 夜來香SAMT基因的分離與原核表達[J]. 熱帶作物學報，2015，36（10）：1831-1838.

[27] 向林. 蠟梅花香相關基因的克隆與功能分析[D]. 武漢：華中農業大學，2009.

[28] 葉蕾. 蠟梅MYB類轉錄因子ODORANT1基因的克隆、轉化與時空表達[D]. 武漢：華中農業大學，2013.

[29] 陳金豆. 蠟梅ODORANT基因功能初探[D].武漢：華中農業大學，2016.

[30] 李旭東. 梅花花香相關基因PmOMT功能與進化的生物信息分析[D]. 北京：北京林業大學，2013.

[31] 安陽. 梅花丁子香酚合酶基因的克隆及功能分析[D]. 北京：北京林業大學，2016.

[32] 孫君. 茉莉花香氣合成相關酶基因克隆與表達分析[D]. 福州：福建農林大學，2014.

[33] 張芊. 雙瓣茉莉開花過程中揮發性物質變化及花香基因差異表達分析[D]. 福州：福建農林大學，2015.

[34] 張雪榮. 薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鑒定及轉進技術研究[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2007.

[35] 郭鳳芝. 玳玳脂氫過氧化物裂解酶基因cDNA全長的克隆[D]. 福州：福建農林大學，2007.

[36] 高耀輝. 神農香菊DiaMYB基因克隆及功能分析[D]. 哈爾濱：東北林業大學，2014.

[37] 張騰旬， 孫明. 烯萜合酶基因的生物信息學分析[J]. 中國觀賞園藝研究進展，2015：337- 345.

[38] 龐宏東， 向林， 趙凱歌， 等. 蠟梅SAMT基因遺傳轉化及其功能分析[J]. 南京林業大學學報（自然科學版），2015，39（6）：29-34.

[39] 龐宏東， 向林，趙凱歌， 等. 蠟梅SAMT 基因在煙草中的遺傳轉化及其功能分析[J]. 北京林業大學學報，2014，36（5）：117-122.

[40] 王佳. 玫瑰花香相關基因RrDXR和RrAAT超表達載體構建及遺傳轉化研究[D]. 揚州： 揚州大學，2015.