番茄斑萎病毒檢測技術(shù)研究進展

覃茜　張艷明　韋勇杰　羅清　謝振興　於艷萍

摘 要：番茄斑萎病毒能侵染多種作物產(chǎn)生嚴重病害，對其進行鑒定和檢測尤為重要。文章從電子顯微技術(shù)、血清學技術(shù)以及分子生物學技術(shù)等三種檢測技術(shù)對番茄斑萎病毒的鑒定及檢測進行了綜述，總結(jié)出番茄斑萎病毒檢測技術(shù)目前存在檢測成本高，試劑毒性大等問題，同時，病毒無法進行離體培養(yǎng)，限制了研究工作的進一步開展。最后展望了多種檢測技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：番茄斑萎病毒 檢測技術(shù) 研究進展

番茄斑萎病毒病的病原為番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus， TSWV），該病毒屬于布尼亞病毒科（Bnuyaviridae），番茄斑萎病毒屬（Tospovirus），主要通過薊馬傳播危害植物，侵染后發(fā)病的癥狀多為嚴重的壞疽，或致使寄主細胞質(zhì)壁分離[1-2]。1919年該病害首次報道于澳大利亞，19世紀80、90年代曾暴發(fā)流行于美國夏威夷、意大利，危害番茄、萵筍等作物，造成毀滅性災(zāi)害，20世紀90年代末，該病迅速在日本各地傳播，現(xiàn)廣泛流行世界各地。目前，番茄斑萎病毒病因其對多種作物均能造成嚴重的危害并造成重大經(jīng)濟損失而被列為世界十大農(nóng)業(yè)病害之一，在國際上備受重視[3-4]。

Tospovirus的病毒粒子為球形，直徑80～110 nm，外層包被一層脂質(zhì)，脂質(zhì)由G1和G2兩種多糖蛋白組成，基因組由3個片段（LRNA，MRNA和SRNA）組成，屬于負單鏈RNA （-ssRNA類型）[5]。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，Tospovirus由最初確定的一個種（TSWV）增加到目前的19個種，其中確定種14個，暫定種5個。Tospovirus寄主廣泛，可侵染84個科1090種植物[6]。再加上該病毒種類繁多、侵染植株癥狀不一，故對其進行鑒定和檢測顯得尤為重要。本文就近年來電子顯微技術(shù)、血清學技術(shù)以及分子生物學技術(shù)等檢測方法在TSWV病毒鑒定檢測中的應(yīng)用進行了綜述。

1 電子顯微技術(shù)

電子顯微技術(shù)是病毒檢測的常用手段，可用于病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其寄主的細胞超微結(jié)構(gòu)變化的觀察。自Kausche等1939年首次在電鏡下觀察到煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）以來，電子顯微技術(shù)就成為植物病毒研究不可或缺的常規(guī)手段之一[7]。寄主植物被TSWV侵染后，體內(nèi)會出現(xiàn)典型的球狀并具包膜的植物病毒粒體，細胞質(zhì)內(nèi)有包含體聚集，可通過電鏡觀察感病植株組織來鑒定，這在電子顯微鑒定上有十分重要的意義[8-10]。

1.1 負染色法（Negative stain）

負染色法以快速簡便著稱，它可直接觀察病毒粒體的大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)、有無包膜等[11]。TSWV的病毒粒子聚集于延伸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中，內(nèi)含體作為其診斷的依據(jù)[12]。經(jīng)電鏡負染色法觀察TSWV，可見該病毒粒體直徑為80～110 nm，球形，一般有1層厚度約5 nm的外膜，外膜的厚度各不相同，有的外膜消失，僅見核殼體[10]。

1.2 超薄切片法（Ultrathin Sectioning）

當病毒侵染植物后，植物細胞會產(chǎn)生具有一定分布特點的特征性內(nèi)含體，利用超薄切片法鑒定觀察，可診斷鑒定病毒病原和細胞病理。王健華等[7]通過對被TSWV侵染的云南烤煙進行超薄切片制樣和染色后觀察發(fā)現(xiàn)受侵染細胞內(nèi)的亞細胞結(jié)構(gòu)隨著侵染時間的增長受破壞程度增大。早期，負染和超薄切片電鏡還有被用于不同株系的巨細胞病毒（Cytomegaoviyns，CMV）的區(qū)分和馬鈴薯Y病毒屬的9個病毒種的鑒別等[13-14]。

1.3 免疫電鏡（Immunosorbent Electron Microscop

y，IEM）

1973年，Derrick K S將免疫學技術(shù)結(jié)合到電鏡技術(shù)當中，發(fā)明出免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)較電鏡技術(shù)更為靈敏，現(xiàn)已成為植物病毒研究的一個重要技術(shù)[15]。后來， Louro D等人在此基礎(chǔ)上發(fā)明了懸浮樣品的膠體金標記免疫修飾法[16]。免疫電鏡的出現(xiàn)為番茄斑萎病毒屬的鑒定提供了便利條件[8]。

2 血清學技術(shù)

檢測植物病毒最為常用和有效的手段之一是血清學技術(shù)。由于不同病毒產(chǎn)生的抗血清各不相同，因此可以用已知病毒的抗血清來鑒定未知病毒的種類[17]。

2.1 免疫膠體金技術(shù)（Immune Colloidal Gold Technique，GICT）

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物的一種新型免疫標記技術(shù)，它應(yīng)用于抗原抗體。1983年，該技術(shù)首次用于檢測植物病毒。之后做了改進，使檢測更為快速簡易。在TSWV檢測上，美國Agdia公司發(fā)明并推廣應(yīng)用了TSWV試紙，給TSWV等的檢測提供了便利[18]。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 是目前應(yīng)用最廣泛的血清學檢測法。自1977年Clark等人發(fā)明了檢測植物病毒的ELISA法[19]，它便在植物病毒檢測中被廣泛應(yīng)用。ELISA測定的基本原理是以酶催化的顏色反應(yīng)指示抗原抗體的結(jié)合，具有所需材料少、操作簡單方便、且多種病毒可同時測定的特點，已得到廣泛的推廣和應(yīng)用。2013年，劉陳晨等利用ELISA檢測重慶煙草上的番茄斑萎病毒[20]。

2.3 雙抗體夾心法（Double Antibody Sandwich，DAS-ELISA）

雙抗體夾心法建立于ELISA的技術(shù)基礎(chǔ)上，具有更高的靈敏性和更強的?；浴＝陙?，此方法被多次應(yīng)用于TSWV的檢測，如馮黎霞等通過此方法，快速地從美國進境的生菜種子中篩選出攜帶有TSWV的樣品[21]。

2.4 三抗酶聯(lián)反應(yīng)吸附測定法（Triple Antibody Sandwich ELISA，TAS-ELISA）

早在70年代，就有先人成功應(yīng)用三抗酶聯(lián)免疫吸附測定法TAS-ELISA檢測病毒的例子。薊馬個體小，常規(guī)方法很難檢測單個薊馬體內(nèi)所攜帶的病毒，但是Roggero等卻應(yīng)用TAS-ELISA成功地檢測到西花薊馬（Frankliniella occidentalis）上的TSWV病毒[22]。

2.5 組織印跡法（Tissue blot-ELISA）

組織印跡法（Tissue blot-ELISA）是在ELISA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測技術(shù)，該方法進行特異性反應(yīng)前，先將待檢樣品在硝酸纖維膜上進行印跡。Whitfield等采用此方法成功檢測到鳳仙花（Impatiens balsamina）等受侵染觀賞植物中的 TSWV[23]。組織印跡法特別適用于大規(guī)模的植物病毒檢測。

3 分子生物學技術(shù)

目前病毒檢測最常用的手段是分子生物學檢測技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點是快速檢測、重復性好，缺點是對核酸質(zhì)量要求高，儀器設(shè)備昂貴等。但是，該檢測技術(shù)也在不斷地更新發(fā)展，衍生出一系列的RT-PCR技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)等。

3.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription-PCR，

RT-PCR）

RT-PCR技術(shù)的優(yōu)點是特異強、快速簡便、靈敏等，它是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。RT-PCR技術(shù)已在90年代就被成功應(yīng)用于TSWV檢測，后來Cortezi等對該技術(shù)做了改進，使檢測更靈敏、可靠[24]。馮黎霞等人對通過DAS-ELISA篩選出攜帶TSWV的生菜種子后進行RT-PCR 檢測，成功的檢測到TSWV[21]。2017年，李潔等人首次利用同樣的技術(shù)對山東地區(qū)的TSWV進行了證實[25]。

3.2 多重RT-PCR技術(shù)（Multiple RT-PCR）

多重RT-PCR技術(shù)是在RT-PCR技術(shù)上建立起來的一種檢測方法，它可以將待測病毒的多對特異性引物反應(yīng)加在同一反應(yīng)體系中。此方法特別適用于同時檢測復合侵染的多種病毒。楊英華等建立了可同時檢測包含TSWV在內(nèi)的多種病毒的多重RT-PCR方法，大大節(jié)省了檢測時間和試劑[26]。代歡歡等利用同樣的方法，將受侵染寄主植物中的TSWV、INSV和IYSV快速、同步、特異地檢測出來[27]。

3.3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Reverse transcription-Loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP）

RT-LAMP技術(shù)是在等溫條件下進行核酸擴增的。與常規(guī)RT-PCR相比，RT-LAMP技術(shù)具有特異性強，檢測時間短等優(yōu)點。2004年，Matsuura等利用高靈敏度的IC/RT-LAMP技術(shù)檢測出TSWV[28]。

3.4 免疫捕捉RT-PCR（Immunocapture reverse

transcription PCR，IC-RT-PCR）

免疫捕捉RT-PCR技術(shù)是RT-PCR與ELISA相結(jié)合的一項新興檢測技術(shù)。該技術(shù)利用病毒?；钥贵w與病毒抗原相結(jié)合，在進行RT-PCR擴增反應(yīng)前將目標病毒在微管或微板等固相上固定好，經(jīng)洗脫處理—富集病毒—RT-PCR反應(yīng)，這種操作過程不需要提取核酸[17]。于翠等人提出以TSWV作為抗原，利用IC-RT-PCR技術(shù)運用到檢測中，可檢測到TSWV[29]。

3.5 實時熒光PCR技術(shù)（Real-time fluorescent

PCR）

實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合了RT-PCR和熒光的優(yōu)點，利用Taq聚合酶的5-端核酸酶活性來切割一個熒光探針，該熒光探針是不能延伸、雙標記的、并且是在擴增過程中與目標序列退火的[30]。實時RT-PCR技術(shù)具有快速靈敏，效率高，可實時檢測，并無需瓊脂糖電泳和EB染色，在一個反應(yīng)管內(nèi)可自動完成，大大減少污染，易定量等優(yōu)點[31]。與步驟繁瑣且實驗過程存在安全隱患的常規(guī)PCR等技術(shù)檢測番茄斑萎病毒相比較，實時熒光PCR技術(shù)不僅可以避免實驗中存在的安全隱患，還縮短了檢測時間，并提高了靈敏度和準確度。因此，目前學者們認為實時熒光PCR技術(shù)是植物病原鑒定和病害診斷的革命性方式，它將成為植物病害診斷的標準方法。利用該技術(shù)可以檢測在被侵染植物和個體薊馬上的TSWV。2000年，Boonham等也利用此方法，檢測西花薊馬上的TSWV [32]。

3.6 核酸分子雜交技術(shù)（Technique of nucleic acid hybridization）

利用病毒基因組序列配對雜交顯示信號檢測病毒的方法叫做核酸分子雜交技術(shù)。該技術(shù)可根據(jù)需要制備單特異性探針，也能制備檢測多種病毒的復合型探針。Aparicio[33]和Serena等[34]分別利用多價復合探針和一個DNA探針成功檢測出包括TSWV在內(nèi)的多種病毒。多價探針的應(yīng)用，有利于節(jié)省檢測時間和成本。

3.7 核酸序列依賴性擴增技術(shù)（Nuleic and sequece based amplipicain，NASBA）

作為在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新擴增技術(shù)，NASBA具有特異性好、靈敏度高、快速、高通量等優(yōu)點，適用于檢測實際樣品。該技術(shù)在1990年被Guatelli首次提出 [35]。2016年，吳興海等人利用NASBA技術(shù)成功檢測出TSWV，建立了可快速檢測TSWV的NASBA技術(shù)[36]。

4 問題與展望

番茄斑萎病毒能侵染多種植物產(chǎn)生病害，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響極大，國內(nèi)外十分重視對該病毒的檢測。番茄斑萎病毒的檢測技術(shù)也隨著科學的進步而不斷的發(fā)展著。目前，該病毒的檢測技術(shù)在不斷地提高，經(jīng)過反復研究及改進，使其檢測技術(shù)更簡便，檢測時間和成本也逐漸減少，而檢測的靈敏度和精確度也在不斷地提高。雖然，番茄斑萎病毒的檢測技術(shù)在不斷進步，但是，目前番茄斑萎病毒的檢測技術(shù)仍存在一些問題：一是檢測所需藥品、儀器價格昂貴；二是檢測所需藥品毒性大，不利于研究；三是病毒本身不能離體培養(yǎng)，這就給研究帶來了很大阻力。

病毒的檢測是研究的基礎(chǔ)，要在研究及防治番茄斑萎病毒引起的植物病害獲得突破，就要從病毒檢測入手。雖然植物病毒檢測比較困難，但是隨著分子生物學技術(shù)發(fā)展，植物病毒檢測技術(shù)取得了很大的進展。利用以上各種方法檢測植物病毒各有優(yōu)劣，實驗中應(yīng)該結(jié)合實際，合理選擇檢測方法，才能更順利的開展實驗。多種檢測技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，是綜合優(yōu)化各種技術(shù)手段的最佳選擇番茄斑萎病毒的檢測在不斷進步著，相信控制該病的發(fā)生指日可待。

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