川芎中抗血栓活性成分的計算機虛擬篩選研究Δ

劉福和，陳少軍，倪文娟（浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，浙江寧波 315100）

川芎中抗血栓活性成分的計算機虛擬篩選研究Δ

劉福和＊，陳少軍，倪文娟（浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，浙江寧波 315100）

目的：運用計算機輔助藥物設(shè)計尋找川芎抗血栓活性成分。方法：以“血栓癥”為關(guān)鍵詞，從治療靶蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索篩選川芎抗血栓靶蛋白；再從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查詢目標靶蛋白并下載其三維結(jié)構(gòu)，采用蛋白質(zhì)預(yù)處理工具確定活性區(qū)域中心坐標，應(yīng)用PyRx和Discovery Studio Visualizer軟件對從臺灣中醫(yī)藥資料庫下載的247個川芎小分子與靶蛋白進行分子對接，通過結(jié)合能篩選出活性成分并分析結(jié)合作用力。結(jié)果：篩選出4個活性成分即新綠原酸、1-H-苯并咪唑-2-胺、3，8-二羥基酰內(nèi)酯、川芎三萜，其分別與凝血酶、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅹa、血栓調(diào)節(jié)蛋白具有較高結(jié)合活性，結(jié)合能分別為－6.1、－4.5、－7.7、－8.6 kJ/mol；分析結(jié)果顯示范德華力、靜電作用力在對接中發(fā)揮著重要作用。結(jié)論：新綠原酸、1-H-苯并咪唑-2-胺、3，8-二羥基酰內(nèi)酯、川芎三萜可能是中藥川芎抗血栓的活性成分。

血栓癥；川芎；計算機輔助藥物設(shè)計；虛擬篩選；靶蛋白；分子對接；活性成分

血栓形成及血栓栓塞性疾病是臨床常見急重癥類疾病，祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將其歸為“血瘀”范疇，治療以益氣活血、祛瘀通絡(luò)為主；而川芎作為常用活血化瘀中藥之一，已被證實具有良好的抗血栓作用；但其提取物中含有揮發(fā)油、生物堿、酚、有機酸及苯酞內(nèi)酯等多種化學(xué)物質(zhì)[1-3]，常規(guī)檢測手段難以有效確定活性成分。計算機輔助藥物設(shè)計（Computeraided drug design，CADD）是一種伴隨計算機技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及人類基因組計劃發(fā)展而形成的新藥開發(fā)技術(shù)，其以計算機化學(xué)研究技術(shù)為基礎(chǔ)，通過對藥物與受體生物大分子的關(guān)系進行模擬、計算及預(yù)算，從而設(shè)計并優(yōu)化合成先導(dǎo)化合物[4]。已有研究顯示，CADD技術(shù)可快速有效地確定中藥有效成分和作用機制，科學(xué)客觀地對中藥獨特藥理作用進行闡述，已成為中藥新藥設(shè)計關(guān)鍵技術(shù)之一[5]。在CADD模式下進行中藥活性成分篩選，需首先對化合物分子進行虛擬篩選，在降低篩選化合物數(shù)量的同時提高先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率[6]。川芎中川芎嗪、阿魏酸的抗血栓作用已被廣泛證實[7]，本次研究采用PyRx軟件的Autodock vina模塊對中藥川芎有抗血栓活性的其他成分進行篩選和評價，擬探討運用CADD尋找中藥川芎新的抗血栓活性成分的可行性及其意義，為中藥川芎的現(xiàn)代化研究提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

治療靶蛋白數(shù)據(jù)庫（Therapeutic target database，TTD，新加坡國立大學(xué)開發(fā)，下載網(wǎng)址：http：//bidd.nus. edu.sg/group/ttd/）；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB，美國紐約結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究實驗室開發(fā)，下載網(wǎng)址：http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）；蛋白質(zhì)預(yù)處理工具[Protein preparing tool，中國醫(yī)科大學(xué)（臺灣）計算與系統(tǒng)生物學(xué)實驗室開發(fā)，下載網(wǎng)址：http：//dock.cmu.edu.tw/ligand. php]；臺灣中醫(yī)藥資料庫[Traditional Chinese Medicine Dadabase@Taiwan，中國醫(yī)科大學(xué)（臺灣）計算與系統(tǒng)生物學(xué)實驗室開發(fā)，下載網(wǎng)址：http：//tcm.cmu.edu.tw/]；PyRx軟件0.8版（美國Scripps研究所開發(fā)）；分子模擬圖形界面軟件（Discovery Studio Visualizer）3.5版（美國Accelrys公司開發(fā)）。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)挖掘 以“血栓癥”“Thrombosis”作為關(guān)鍵詞，從TTD中搜索與其相關(guān)的蛋白，作為川芎抗血栓的靶蛋白，并且對相應(yīng)的文獻進行查詢及篩選，選取試驗所需的目標靶蛋白[8-11]。

1.2.2 受體結(jié)構(gòu)信息來源及處理 根據(jù)篩選結(jié)果，從PDB中搜索目標靶蛋白并下載其三維結(jié)構(gòu)，然后采用Protein preparing tool進行預(yù)處理，主要包括刪去自帶的配體小分子、分配相關(guān)電荷及加氫，然后以自帶配體位置為中心，確定活性區(qū)域的中心坐標；預(yù)處理完成后蛋白可用于后續(xù)分子對接。以凝血酶為例，預(yù)處理前、后的三維結(jié)構(gòu)圖見圖1。

圖1 凝血酶預(yù)處理前后的三維結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Three-dimensional structures of thrombin beforeand after pretreatment

1.2.3 配體小分子化合物庫準備 從臺灣中醫(yī)藥資料庫中下載本次研究的247個川芎分子結(jié)構(gòu)，下載的川芎各小分子均符合LipinskiCA提出的“類藥五原則”：（1）分子量小于500；（2）氫鍵給體數(shù)目小于5；（3）氫鍵受體數(shù)目小于10；（4）脂水分配系數(shù)小于5；（5）可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個[12]。將各分子mol2結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成PyRx軟件能認可的pdbqt格式，三維結(jié)構(gòu)均采用MM 2力場進行優(yōu)化。應(yīng)用PyRx軟件中的Open babel模塊對川芎各個小分子進行能量最小優(yōu)化。

1.2.4 分子對接 川芎活性成分與靶蛋白的匹配情況應(yīng)用PyRx軟件中Autodock vina模塊進行分子對接，根據(jù)結(jié)合能的大小進行打分。結(jié)合位點坐標參照各蛋白自帶配體的坐標，運用Grid box（盒子）將蛋白質(zhì)嵌入一個三維網(wǎng)格中，Grid box大小設(shè)定為9埃米（?，1?＝10－10m）×9?×9?；另血栓調(diào)節(jié)蛋白（1DQB）晶體結(jié)構(gòu)因不自帶配體，結(jié)合位點及Grid box大小采用默認值，可以涵蓋各個活性位點。除具體坐標外的其他參數(shù)均采用默認值。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與圖像處理 采用Discovery Studio Visualizer對分子對接結(jié)果進行分析并制作三維和二維圖像。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

在TTD中，共檢索到30余種靶蛋白，涉及止血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)等多個環(huán)節(jié)。選擇與血栓癥密切關(guān)聯(lián)的4個靶蛋白，即凝血酶、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅹa、血栓調(diào)節(jié)蛋白，而這些靶蛋白也是川芎抗血栓作用研究的熱點。

2.2 分子對接結(jié)果

下載247個川芎小分子配體與靶蛋白進行對接，結(jié)果顯示新綠原酸（Neochlorogenic acid）、1-H-苯并咪唑-2-胺（1-H-benzim idazole-2-amine）、3，8-二羥基酰內(nèi)酯（3，8-dihydrodiligustilide）、川芎三萜（Chuanxiongterpene）分別與凝血酶、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅹa、血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合具有較低結(jié)合能，可作為靶蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物加以研究。靶蛋白的靶標名稱及篩選結(jié)合位點坐標見表1，川芎活性成分與靶蛋白對接的結(jié)合能見表2。

表1 靶蛋白的靶標名稱及篩選結(jié)合位點坐標Tab 1 Target nam e of target protein and coordinates of screening binding site

表2 川芎活性成分與靶蛋白對接的結(jié)合能（kJ/mol）Tab 2 Binding energy of active ingredientsof chuanxiong rhizoma docking w ith target protein（k J/mol）

2.3 對接結(jié)果分析

2.3.1 新綠原酸與凝血酶的相互作用 川芎的247個小分子配體與凝血酶進行分子對接后，新綠原酸與凝血酶的結(jié)合能最低，為－6.1 kJ/mol；其對接效果見圖2（圖C中“HIS”等為氨基酸縮寫，下同）。

圖2 新綠原酸與凝血酶分子對接效果圖Fig 2 Docking renderings of chlorogenic acid w ith throm binm olecules

從圖2C可以看出，范德華力在此對接中起重要作用；同時GLY233與新綠原酸形成了氫鍵。

2.3.2 1-H-苯并咪唑-2-胺與抗凝血酶Ⅲ的相互作用 川芎的247個小分子配體與抗凝血酶Ⅲ進行分子對接后，1-H-苯并咪唑-2-胺與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合能最低，為－4.5 kJ/mol；其對接效果見圖3。

圖3 1-H-苯并咪唑-2-胺與抗凝血酶Ⅲ分子對接效果圖Fig 3 Docking renderings of 1-H-benzim idazole-2-am inew ith antithrombinⅢ

從圖3C可以看出，靜電作用力在此對接中起著重要作用；同時，LYS193、NAG861與1-H-苯并咪唑-2-胺形成了鹽橋，這是離子π-π相互作用引起的。

2.3.3 3，8-二羥基酰內(nèi)酯與凝血因子Ⅹa的相互作用 川芎的247個小分子配體與凝血因子Ⅹa進行分子對接后，3，8-二羥基酰內(nèi)酯與凝血因子Ⅹa的結(jié)合能最低，為－7.7 kJ/mol；其對接效果見圖4。

圖4 3，8-二羥基酰內(nèi)酯與凝血因子Ⅹa對接效果圖Fig 4 Docking renderings of 3，8-dihydrodiligustilidew ith coagulation factorⅩa

從圖4C可以看出，范德華力在此對接中起著重要作用。

2.3.4 川芎三萜與血栓調(diào)節(jié)蛋白的相互作用 川芎的247個小分子配體與血栓調(diào)節(jié)蛋白進行分子對接后，川芎三萜與血栓調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合能最低，為－8.6 kJ/mol；其對接效果見圖5。

圖5 川芎三萜與血栓調(diào)節(jié)蛋白的對接效果圖Fig 5 Docking renderings of chuanxiongterpene w ith thrombomodulin

從圖5C可以看出，范德華力與靜電作用力在此對接中起著重要作用。

3 討論

傳統(tǒng)藥物研究方法為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究奠定了良好基礎(chǔ)，但由于中藥自身具有多組分的特點，涉及有效藥物成分、配伍、人體內(nèi)吸收及代謝等問題存在，常規(guī)試驗研究技術(shù)用于中藥活性成分檢測具有較大盲目性[13]。首先，中藥中含有多類微量成分故無法通過傳統(tǒng)分離篩選方法確定其作用機制及藥理作用；其次，中藥篩選目前多采用基于疾病特征的動物實驗?zāi)Ｐ瓦M行，難以從分子機制上闡明中藥作用機制；最后，目前尚無可描述中藥傳統(tǒng)功效及科學(xué)內(nèi)涵的符合中醫(yī)藥理論評價的模型[14]。

臺灣中醫(yī)藥資料庫是全世界目前最大的中醫(yī)藥小分子化合物數(shù)據(jù)庫之一，數(shù)據(jù)庫中包含了453種中藥的小分子化合物，共含有超過20 000種的小分子化學(xué)成分；數(shù)據(jù)庫提供了中藥小分子活性成分虛擬篩選、分子對接及分子動力學(xué)模擬等應(yīng)用工具，可有效解決中西藥分歧[15]，故本試驗采用此庫作為依據(jù)。

相較于傳統(tǒng)藥物研發(fā)方法，CADD技術(shù)能夠顯著提高藥物設(shè)計速度，減少藥物創(chuàng)新工作所需人力和物力。而虛擬篩選技術(shù)應(yīng)用可在生物活性篩選前以計算機對化合物分子進行提前篩選，主要目的為降低實際篩選化合物數(shù)目，提高先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率；其中分子對接技術(shù)應(yīng)用最為普遍，即從小分子數(shù)據(jù)庫中檢索能與之匹配的候選化合物，通過計算機對接技術(shù)評價已知藥物分子與受體大分子間是否可相互結(jié)合，并對兩者間相互作用親和力及結(jié)合模式進行評價[16]。分子對接由于從整體上考慮配體與受體的結(jié)合效果，因而能更好地避免其他方法的弊端，例如局部作用較好而整體結(jié)合欠佳的狀況[17]。本次研究中采用的PyRx軟件是應(yīng)用較為廣泛的對接軟件之一，其能夠自動模擬配體在受體活性位點的作用情況，記錄最優(yōu)相互作用方式，并具有配體三維數(shù)據(jù)庫搜索功能。

本研究運用PyRx軟件的Autodock vina模塊對中藥川芎中除川芎嗪和阿魏酸外的其他抗血栓活性成分進行篩選，從247種川芎成分中篩選出活性分子新綠原酸、1-H-苯并咪唑-2-胺、3，8-二羥基酰內(nèi)酯、川芎三萜分別與凝血酶、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅹa、血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合活性較高；然后運用Discovery Studio Visualizer軟件對分子對接最匹配的蛋白復(fù)合物相互作用力進行分析，其結(jié)合能分別為－6.1、－4.5、－7.7、－8.6 kJ/mol，證實范德華力和靜電作用力在各自的對接中起著重要作用。已有研究顯示，新綠原酸可以減少剪切應(yīng)激引起的血小板聚集；凝血酶GLY233對酶水解專一性具有決定作用，并可識別和定位底物[18]。從圖2C可以看出，新綠原酸與凝血酶核心氨基酸均有相互作用。以上均說明川芎活性成分與靶蛋白的核心氨基酸存在相互的作用力。而二維圖可以幫助了解川芎活性成分與受體對接的作用力和位置結(jié)合等情況，有助于闡述抗血栓作用機制。

綜上所述，活性分子新綠原酸、1-H-苯并咪唑-2-胺、3，8-二羥基酰內(nèi)酯、川芎三萜可能是中藥川芎抗血栓的活性成分。本文建立的方法彌補了傳統(tǒng)藥理學(xué)實驗方法的不足，提高了先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)效率，在中藥藥理學(xué)研究中具有可行性。

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Study on the Computer Virtual Screening of Antithrombotic Active Ingredients in Chuanxiong Rhizoma

LIU Fuhe，CHEN Shaojun，NIWenjuan（School of Pharmacy，Zhejiang Pharmaceutical College，Zhejiang Ningbo 315100，China）

OBJECTIVE：To find the active ingredient of on antithrombotic chuanxiong rhizoma using computer aided drug design.METHODS：Using“thrombosis”as keyword，thrombosis related proteinswere searched and screened in therapeutic target database；target proteins’three-dimensional structure were downloaded in protein database，then the protein preparing tool were used to determine the coordinates of the active area center.PyRx software and Discovery Studio Visualizer were used to match the 247 smallmolecules of chuanxiong rhizoma w ith target protein that downloaded from Taiwan traditional Chinesemedicine database.The active molecules were screened and binding force was analyzed.RESULTS：Active molecules of neochlorogenic acid，1-H-benzimidazole-2-amine，3，8-dihydrodiligustilide，chuanxiongterpene were selected by blinding energy，and there were high binding activity among these activemolecules，thrombin，antithrombinⅢ，coagulation factorⅩa and thrombomodulin，and the binding energy were－6.1，－4.5，－7.7，－8.6 kJ/mol.Analysis results showed van Edward force and electrostatic interactions played an important role in their respective docking.CONCLUSIONS：Neochlorogenic acid，1-H-benzim idazole-2-am ine，3，8-dihydrodiligusti-lide，chuanxiongterpenemay be the antithrombotic activity ingredients of Chuanxiong rhizoma.

Thrombogenesis；Chuanxiong rhizoma；Computer aided drug design；Virtual screening；Target protein；Molecular docking；Active ingredients

R9-39

A

1001-0408（2017）16-2182-05 DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.06

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（No.LY15H280009）

＊講師，碩士。研究方向：中藥藥理。電話：0574-88223170。E-mail：89994226@qq.com