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葛根芩連結腸定位片對濕熱內蘊型潰瘍性結腸炎模型兔結腸組織PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達的影響Δ

2017-07-03 14:56:57宋信莉張石宇郭光偉貴陽中醫學院藥學院貴陽55000貴陽中醫學院第一附屬醫院藥劑科貴陽55000貴州拜特制藥有限公司貴陽55000
中國藥房 2017年16期
關鍵詞:劑量模型

宋信莉,張石宇,郭光偉,劉 文#,章 宏(.貴陽中醫學院藥學院,貴陽 55000;.貴陽中醫學院第一附屬醫院藥劑科,貴陽 55000;.貴州拜特制藥有限公司,貴陽 55000)

葛根芩連結腸定位片對濕熱內蘊型潰瘍性結腸炎模型兔結腸組織PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達的影響Δ

宋信莉1*,張石宇2,郭光偉1,劉 文1#,章 宏3(1.貴陽中醫學院藥學院,貴陽 550002;2.貴陽中醫學院第一附屬醫院藥劑科,貴陽 550002;3.貴州拜特制藥有限公司,貴陽 550002)

目的:觀察葛根芩連結腸定位片(GGQLJC)對濕熱內蘊型潰瘍性結腸炎(UC)模型兔結腸組織過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR-γ)和核因子κB(NF-κB p65)蛋白表達的影響。方法:將56只家兔隨機分為正常組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、柳氮磺胺吡啶片(SASP)組(陽性對照,0.300 g/kg)、葛根芩連片(GGQL)組(0.225 g/kg)和GGQLJC高、中、低劑量組(1.036、0.518、0.259 g/kg),每組8只。除正常組外,其余各組兔復制濕熱內蘊型UC模型,于造模結束后次日ig給藥,每天1次,連續14 d。對兔疾病活動度指數(DAI)、結腸黏膜損傷指數(CMDI)、組織學損傷(TDI)進行評分,測定結腸、脾、胸腺指數,并檢測結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達。結果:與正常組比較,模型組兔DAI、CMDI和TDI評分以及結腸指數、脾指數、結腸組織中NF-κB p65蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01),胸腺指數、結腸組織中PPAR-γ蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01);與模型組比較,各給藥組兔上述指標均顯著改善(P<0.05或P<0.01);與GGQL組比較,SASP組和GGQLJC高、中劑量組兔DAI和TDI評分、脾指數、結腸指數、結腸組織中NF-κB p65蛋白表達水平以及SASP組和GGQLJC高劑量組兔CMDI評分均顯著降低(P<0.05),SASP組和GGQLJC高、中劑量組兔結腸組織中PPAR-γ蛋白表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。結論:GGQLJC對濕熱內蘊型UC模型兔有一定改善作用,且作用優于GGQL;其機制可能與上調結腸組織中PPAR-γ蛋白表達和下調NF-κB p65蛋白表達有關。

葛根芩連結腸定位片;濕熱內蘊型潰瘍性結腸炎;過氧化物酶增殖物激活受體;核因子κB;家兔

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種非特異性結腸和直腸炎癥性慢性疾病,病因不明,是胃腸道較嚴重的疾病之一。該病的發生與遺傳、環境、免疫及炎癥介質等因素密切相關,其中免疫紊亂是關鍵環節[1]。研究表明,過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR-γ)具有強大的抗炎及調節免疫的作用,其主要是通過抑制核因子κB(NF-κB)介導的信號轉導通路發揮抗炎作用。NF-κB是一種具有多向性轉錄調節作用的核蛋白因子,最常見的存在形式是由p65與p50亞基組成的異二聚體,UC的發病與NF-κB p65的表達密切相關[2]。

葛根芩連片(簡稱為“GGQL”)源于張仲景《傷寒論》中的葛根芩連湯,具有解表清里的功效,多用于治療太陽表邪內陷所致熱下利證,對濕熱內蘊型UC療效顯著[3]。但GGQL口服給藥后藥物容易在胃和小腸部位被吸收,真正達到結腸的藥物不多,影響了其療效。為了解決這一問題,本課題組前期進行了葛根芩連結腸定位片(簡稱為“GGQLJC”)的研究,該定位片在人工胃液中放置2 h、在人工腸液中放置4 h指標性成分均基本不釋放;當其到達結腸后,指標性成分開始釋放,在結腸12 h內的累積釋放率達92%[4],體現了定位釋放的特點。本研究旨在探討GGQLJC對濕熱內蘊型UC家兔結腸黏膜PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達的影響,以探討GGQLJC治療濕熱內蘊型UC的作用機制,同時比較其與傳統GGQL的療效差異。

1 材料

1.1 儀器

BX-51顯微鏡(日本Olympus公司);MK-4酶標儀(芬蘭雷勃公司);IMS圖象分析系統(上海哈靈生物技術有限公司);D5100數碼相機(日本Nikon公司)。

1.2 藥品與試劑

GGQLJC(貴陽中醫學院自制,批號:20150211,規格:0.044 g/片);GGQL(太極集團四川綿陽制藥有限公司,批號:150121501,規格:0.5 g/片);柳氮磺胺吡啶片(SASP,上海中西三維藥業有限公司,批號:20150208,規格:0.25 g/片);兔NF-κB p65一抗(美國Sigma公司,批號:SAB4504488);兔PPAR-γ一抗(英國AmyjetScientific公司,批號:ab68542);羊抗鼠/兔免疫球蛋白G(IgG)聚合物(福州邁新生物技術有限公司,批號:282840407JF);蜂蜜(貴州夜郎蜂業科技有限公司,批號:111455K2);白酒(52°,北京紅星股份有限公司,批號:GB/T20832)。

1.3 動物

健康家兔56只,♀♂各半,體質量為2~2.5 kg,購自貴陽醫學院實驗動物中心[許可證號:SCXK(黔)2012-001]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將56只兔隨機分為7組,每組8只,分別為正常組、模型組、GGQL組(0.225g/kg)、SASP組(0.300g/kg)[5]和GGQLJC高、中、低劑量組(1.034、0.518、0.259g/kg)[5]。動物適應性喂養7d后,除正常組外,其余6組兔均采用高脂高糖飲食加化學刺激法[5]建立濕熱內蘊型UC模型,并于造模結束后次日開始給藥(藥物均以生理鹽水溶解),每天ig給藥1次,連續14d,期間正常飲食;正常組和模型組兔ig生理鹽水。

2.2 一般情況觀察

每天記錄兔的飲食、體質量、大小便、毛色、精神等情況。

2.3 標本采集及檢測

末次給藥后家兔禁食不禁水1d,空氣栓塞處死并解剖,取脾、胸腺并稱質量;取結腸并測定其總長度,并自距離肛門2cm處向上取結腸8cm,沿腸系膜縱向剪開腸腔,用生理鹽水沖洗干凈并吸干水分,稱質量;肉眼觀察結腸(生理鹽水漂洗3次并吸干水分)大體形態,并對結腸黏膜損傷指數(CMDI)進行評分;剪取病變明顯結腸段標本作病理切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后觀察病理變化,對組織學損傷(TDI)進行評分;采用免疫組化法檢測結腸組織中PPAR-γ、NF-κBp65蛋白表達。

2.4 疾病活動情況觀察

分別在給藥第1、7、14天對兔進行疾病活動指數(DAI)評分,記錄兔的體質量變化、大便性狀、大便隱血情況,分別按0~4分的分值范圍對體質量下降百分比、大便性狀和大便血便情況進行評分;DAI=(體質量下降百分比評分+大便性狀評分+大便隱血評分)/3[5-6]。

2.5 結腸指數、脾指數和胸腺指數測定

根據“2.3”項下數據,計算兔臟器(結腸、脾、胸腺)指數[臟器質量(mg)/體質量(g)]。

2.6 CMDI評分

[7-8]中方法進行CMDI評分。肉眼觀察結腸黏膜變化:0分(黏膜無損傷),1分(黏膜充血、水腫,無潰瘍),2分(黏膜充血、水腫、輕度糜爛,無潰瘍),3分(黏膜充血、水腫、中度糜爛,有單個潰瘍),4分(黏膜充血、水腫、高度糜爛,有多個潰瘍),5分(黏膜充血、水腫、重度糜爛,有>1cm的潰瘍)。

2.7 TDI評分

參考文獻[9]中方法進行TDI評分:0分(未見明顯損傷),1分(腸絨毛結構無破壞),2分(中等水平淋巴細胞浸潤、腸隱窩加深、腸壁增厚但未侵及肌層,無潰瘍),3分(呈高水平淋巴細胞浸潤、腸壁增厚且侵及肌層,無潰瘍),4分(明顯淋巴細胞浸潤、腸隱窩加深變形、腸壁增厚且侵及肌層,伴潰瘍)。

2.8 結腸組織中PPAR-γ、NF-κBp65蛋白表達測定

采用鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)法[10]測定。切片脫蠟后滴加3%過氧化氫,放置15min,然后將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液中冷卻至室溫,滴加5%牛血清白蛋白封閉液封閉20min,分別加入兔PPAR-γ、NF-κB p65一抗,4冷凍過夜;滴加羊抗鼠/兔IgG聚合物,于37培養箱中孵育20min,然后滴加SABC,在37培養箱中孵育20min,再加入二氨基聯苯胺顯色劑,蘇木精輕度復染;經乙醇脫水、二甲苯透明,最后中性樹膠封片,顯微鏡觀察結果。PPAR-γ、NF-κBp65蛋白表達陽性為胞質呈棕黃色顆粒,顏色越深即表達越強;未出現棕黃色顆粒則為陰性。采用BI-2000圖象分析系統,對每張切片隨機選取5個視野測量陽性細胞平均積分光密度值(IOD),IOD值越大則表明蛋白表達越強。

2.9 統計學方法

采用SPSS20.0統計學軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示,當資料滿足正態分布且方差齊時,采用單因素方差分析;如不滿足上述條件則采用非參數秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況觀察結果

造模前,兔毛色潔白有光澤,反應靈敏,喜活動,大小便及糞便質地均正常。造模中,兔站立不穩、呼吸加快,隨后出現嗜睡懶動的現象,后期出現大便黏滯不爽、腹瀉等癥狀。造模后,兔出現黏液膿血便、稀便,肛周污穢,與正常組兔糞便差別明顯;不喜活動,無食欲,倦怠。造模48h內模型組死亡2只,GGQLJC低劑量組及GGQL組各死亡1只。連續給藥10d后,各給藥組兔一般情況均有顯著改善,黏液、膿血便等癥狀明顯減少或消失,但整體狀態與正常組仍有差距,其中GGQLJC高劑量組和SASP組兔恢復最好。

3.2 DAI評分結果

給藥第1、7、14天后,與正常組比較,各組兔DAI評分均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。給藥第7天后,與模型組比較,各給藥組兔DAI評分均顯著降低(P<0.01)。給藥第14天后,與模型組比較,各給藥組兔DAI評分均顯著降低(P<0.01);與GGQL組比較,SASP組和GGQLJC高、中劑量組兔DAI評分顯著降低(P<0.05),且GGQLJC高、中劑量組與SASP組降低程度相當(P>0.05),結果詳見表1。

3.3 結腸指數、脾指數及胸腺指數測定結果

與正常組比較,各組兔結腸指數、脾指數顯著升高(P<0.01),胸腺指數顯著降低(P<0.01);與模型組比較,各給藥組兔結腸指數、脾指數均顯著降低(P<0.05或P<0.01),胸腺指數均顯著升高(P<0.05);與GGQL組比較,SASP組和GGQLJC高、中劑量組兔結腸指數和脾指數顯著降低(P<0.05),且GGQLJC高、中劑量組與SASP組降低程度相當(P>0.05),結果詳見表2。

3.4 CMDI、TDI評分結果

與正常組比較,各組兔CMDI、TDI評分均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,各給藥組兔CMDI、TDI評分均顯著降低(P<0.05或P<0.01);與GGQL組比較,SASP組和GGQLJC高劑量組兔CMDI、TDI評分以及GGQLJC中劑量組兔TDI評分均顯著降低(P<0.05),且GGQLJC高劑量組與SASP組降低程度相當(P>0.05),結果詳見表3。

表1 各組兔DAI評分結果(±s)Tab 1 Resultsof DAIscoring of rabbits in each group(±s)

表1 各組兔DAI評分結果(±s)Tab 1 Resultsof DAIscoring of rabbits in each group(±s)

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與GGQL組比較,ΔP<0.05;與SASP組比較,☆P<0.05Note:vs.normal group,*P<0.05,**P<0.01;vs.model group,##P<0.01;vs.GGQL group,ΔP<0.05;vs.SASPgroup,☆P<0.05

給藥第14天0.042±0.118 2.954±0.743**0.667±0.509*##0.375±0.425*##Δ0.458±0.396*##Δ0.583±0.427*##Δ0.581±0.378*##☆組別正常組模型組GGQL組SASP組GGQLJC高劑量組GGQLJC中劑量組GGQLJC低劑量組n8678887給藥第1天0.042±0.118 2.611±0.574**2.619±0.300**2.625±0.330**2.542±0.248**2.625±0.576**2.762±0.418**給藥第7天0.042±0.118 2.944±0.743**1.286±0.678**##0.958±0.518**##1.042±0.653**##1.292±0.547**##1.381±0.621**##

表2 各組兔結腸指數、脾指數及胸腺指數測定結果(±s,mg/g)Tab 2 Results of colon index,sp leen index,thymus index of rabbits in each group(±s,m g/g)

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與GGQL組比較,ΔP<0.05;與SASP組比較,☆P<0.05Note:vs.normal group,*P<0.05,**P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01;vs.GGQL group,ΔP<0.05;vs.SASPgroup,☆P<0.05

胸腺指數1.291±0.111 0.751±0.131**0.929±0.170**#0.967±0.131**#0.962±0.164**#0.939±0.089**#0.958±0.122**#組別正常組模型組GGQL組SASP組GGQLJC高劑量組GGQLJC中劑量組GGQLJC低劑量組n8678887結腸指數0.334±0.034 1.145±0.187**0.587±0.111**##0.503±0.045**##Δ0.539±0.086**##Δ0.524±0.110**##Δ0.642±0.118**##☆脾指數0.288±0.031 0.458±0.057**0.364±0.033*##0.347±0.031*##Δ0.345±0.051*##Δ0.353±0.046*##Δ0.367±0.024*##☆

表3 各組兔CMDI、TDI評分結果(±s)Tab 3 Results of CMDI,TDI scoring of rabbits in each group(±s)

表3 各組兔CMDI、TDI評分結果(±s)Tab 3 Results of CMDI,TDI scoring of rabbits in each group(±s)

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與GGQL組比較,ΔP<0.05;與SASP組比較,☆P<0.05Note:vs.normalgroup,*P<0.05,**P<0.01;vs.modelgroup,#P<0.05,##P<0.01;vs.GGQLgroup,ΔP<0.05;vs.SASPgroup,☆P<0.05

TDI 0.128±0.355 3.671±0.520**2.432±0.978*##1.630±0.519*##1.753±0.717*##Δ2.111±0.758*##Δ☆2.720±0.761*##☆組別正常組模型組GGQL組SASP組GGQLJC高劑量組GGQLJC中劑量組GGQLJC低劑量組n8678887 CMDI 0.126±0.344 4.177±0.743**3.020±0.567*#2.130±0.631*##2.248±0.457*##Δ3.136±0.989*#☆3.285±0.949*#☆

3.5 結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達測定結果

與正常組比較,各組兔結腸組織中PPAR-γ蛋白表達減弱、NF-κB p65蛋白表達增強(P<0.01);與模型組比較,各給藥組兔結腸組織中PPAR-γ蛋白表達增強、NF-κB p65蛋白表達減弱(P<0.05或P<0.01);與GGQL組比較,SASP組和GGQLJC高、中劑量組兔結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達均顯著改善(P<0.05或P<0.01),且GGQLJC高劑量組兔結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達以及GGQLJC中劑量組兔結腸組織中NF-κB p65蛋白表達與SASP組改善程度相當(P>0.05),免疫組化圖詳見圖1、蛋白測定結果詳見表4。

4 討論

圖1 各組兔結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達免疫組化圖(×200)Fig 1 Imm unohistochem istry pictures of PPAR-γ,NF-κB p65 protein expression in colon tissue of rabbits in each group(×200)

中醫認為,UC屬于中醫學“泄瀉”“久痢”“腸癖”“腹痛”“腸風”“下血”等范疇[1]。西醫治療UC多采用水楊酸制劑、腎上腺皮質激素、免疫抑制劑等,取得了一定療效,其中SASP是臨床上公認的治療UC的化學藥,但SASP存在不良反應大、價格昂貴等問題。

在本研究中,筆者通過對兔一般情況進行觀察,對DAI、CMDI、TDI進行評分,以及檢測臟器(結腸、脾、胸腺)指數等,比較了SASP與不同劑量GGQLJC以及傳統劑型GGQL治療濕熱內蘊型UC兔的作用強弱,并通過檢測結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達探討了其作用機制。結果,給藥后能夠緩解濕熱內蘊型UC兔的一般癥狀,降低DAI、CMDI、TDI評分,降低結腸指數、脾指數,升高胸腺指數,其中以高劑量GGQLJC及SASP作用效果最優,且比傳統GGQL效果更顯著。GGQLJC還能夠上調模型兔結腸組織中PPAR-γ蛋白表達和下調NF-κB p65蛋白表達。

綜上,本研究結果證實了GGQLJC能夠上調兔結腸組織中PPAR-γ蛋白表達、下調結腸組織中NF-κB p65蛋

表4 各組兔結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達測定結果(±s)Tab 4 Results of PPAR-γ,NF-κB p65 protein expressions in colon tissue of rabbits in each group(±s)

表4 各組兔結腸組織中PPAR-γ、NF-κB p65蛋白表達測定結果(±s)Tab 4 Results of PPAR-γ,NF-κB p65 protein expressions in colon tissue of rabbits in each group(±s)

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與GGQL組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與SASP組比較,☆P<0.05,☆☆P<0.01Note:vs.normal group,*P<0.05,**P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01;vs.GGQL group,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;vs.SASP group,☆P<0.05,☆☆P<0.01

組別正常組模型組GGQL組SASP組GGQLJC高劑量組GGQLJC中劑量組GGQLJC低劑量組NF-κBp65 0.138±0.020 0.312±0.040**0.244±0.034*#0.191±0.025**##Δ0.208±0.036*##Δ0.221±0.027*##Δ0.286±0.067**#☆☆n8678887 PPAR-γ 0.333±0.028 0.185±0.008**0.268±0.025*##0.315±0.031##ΔΔ0.304±0.012##ΔΔ0.283±0.019*##Δ☆0.258±0.026*##☆☆

白表達,這可能是其治療UC的免疫學機制之一。

參考文獻

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Effects of Gegenqin lian Colon Positioning Tablet on Colon Tissue PPAR-γ,NF-κB p65 Protein Expressions of M odel Rabbitsw ith Damp-heat Type Ulcerative Colitis

SONG Xinli1,ZHANG Shiyu2,GUO Guangwei1,LIUWen1,ZHANG Hong3(1.School of Pharmacy,Guiyang University of Chinese Medicine,Guiyang 550002,China;2.Dept.of Pharmacy,the First A ffiliated Hospital of Guiyang University of Chinese Medicine,Guiyang 550002,China;3.Guizhou Beit Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guiyang 550002,China)

OBJECTIVE:To observe the effects of Gegenqinlian colon positioning tablet(GGQLJC)on colon tissue PPAR-γ,NF-κB p65 protein expressions ofmodel rabbitsw ith damp-heat type ulcerative colitis(UC).METHODS:56 rabbitswere randomly divided into normal group(normal saline),model group(normal saline),sulfasalazine tablet(SASP)group(positive control,0.300 g/kg),Gegenqinlian tablet(GGQL)group(0.225 g/kg)and GGQLJC high-dose,medium-dose,low-dose groups(1.036,0.518,0.259 g/kg),8 in each group.Except for normal group,rabbits in other groupswere cultured for damp-heat-type UC model,intragastrically adm inistrated in the second day of last adm inistration,once a day,for 14 d.Disease activity index(DAI),colonic mucosal damage index(CMDI),histological damage(TDI)were scored;colon,spleen and thymus indexes were determ ined;PPAR-γ,NF-κB p65 protein expressions in colon tissue were detected.RESULTS:Compared w ith normal group,DAI,CMDI,TDI scores and spleen index,colon index,NF-κB p65 protein level in colon tissue in model group were significantly increased(P<0.01);thymus index,PPAR-γprotein level in colon tissue were significantly reduced(P<0.01).Compared w ithmodel group,above-mentioned indexes in each adm inistration group were significantly improved(P<0.05 or P<0.01).Compared w ith GGQL group,DAI and TDI scores,spleen index,colon index,NF-κB p65 protein level in colon tissue in SASP group,GGQLJC high-dose,medium-dose groups were significantly decreased(P<0.05);PPAR-γprotein level in colon tissue in SASP group,GGQLJC high-dose,medium-dose groups were significantly increased(P<0.05 or P<0.01).CONCLUSIONS:GGQLJC has certain improvement effects on model rabbits w ith damp-heat type UC,which is superior to GGQL.Themechanism may be related to increasing PPAR-γprotein level and decreasing NF-κB p65 protein level in colon tissue.

Gegenqinlian colon positioning tablet;Damp-heat type ulcerative colitis;PPAR-γ;NF-κB p65;Rabbit

R283.6

A

1001-0408(2017)16-2186-05

2016-08-07

2017-03-12)

(編輯:林 靜)

貴州省優秀青年科技人才培養對象專項項目(No.黔科合人字〔2011〕28號)

*副教授,碩士。研究方向:中藥新技術與新制劑。電話:0851-8233005。E-mail:392347047@qq.com

#通信作者:教授,碩士,碩士生導師。研究方向:中藥新技術與新制劑。電話:0851-8233005。E-mail:642771631@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.07

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