山銀花水提物體外抗甲型H1N1流感病毒的作用研究Δ

陳 靈，周艷萌，歐水平，任 麗（1.遵義醫學院附屬醫院藥物臨床試驗機構，貴州遵義 56000；.遵義醫學院微生物學與免疫實驗室，貴州遵義 56006；.遵義醫學院附屬醫院藥劑科，貴州遵義 56000；.遵義醫學院藥學院，貴州遵義 56006）

山銀花水提物體外抗甲型H1N1流感病毒的作用研究Δ

陳 靈1＊，周艷萌2，歐水平3，任 麗4（1.遵義醫學院附屬醫院藥物臨床試驗機構，貴州遵義 563000；2.遵義醫學院微生物學與免疫實驗室，貴州遵義 563006；3.遵義醫學院附屬醫院藥劑科，貴州遵義 563000；4.遵義醫學院藥學院，貴州遵義 563006）

目的：考察山銀花水提物（SYHW）體外抗甲型H1N1流感病毒（H1N1病毒）的作用。方法：以H1N1病毒感染體外培養的犬腎小管上皮細胞（MDCK細胞），計算病毒的半數組織培養感染劑量（TCID50）；以不同質量濃度SYHW作用MDCK細胞24 h，考察其最大無毒濃度。然后將試驗分為正常細胞組、病毒對照組和SYHW預防給藥組、治療給藥組和直接殺滅給藥組（均給予最大無毒濃度的SYHW，并以100 TCID50H1N1病毒感染細胞），測定SYHW的抗病毒有效率（ER）；將試驗分為正常細胞組、病毒對照組和SYHW治療給藥組、直接殺滅給藥組（給藥及病毒感染方法同上），分別測定細胞增殖指數（PI）和細胞凋亡率的變化。結果：H1N1病毒的100 TCID50為1.26×10－7，SYHW對MDCK細胞的最大無毒濃度為50μg/m L（細胞存活率為91.3%）。SYHW預防給藥組、SYHW治療給藥組和SYHW直接殺滅給藥組的ER分別為0、80.3%、52.7%。與正常細胞組比較，病毒對照組細胞的PI值顯著降低（P＜0.05），早期、晚期凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與病毒對照組比較，SYHW直接殺滅給藥組細胞的PI值顯著升高、早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），SYHW治療給藥組細胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05）。結論：SYHW具有體外抗H1N1病毒的作用，且以治療給藥和直接殺滅給藥抗病毒作用較好。

山銀花；水提物；MDCK細胞；甲型H1N1流感病毒；體外

流行性感冒（簡稱“流感”）是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道傳染病，以急起高熱、全身酸痛、乏力并伴輕度呼吸道癥狀為臨床特點。在各型流感病毒中，宿主范圍最廣、對人類健康影響最大的是甲型流感病毒[1]。目前，治療流感的化學藥主要有抗病毒藥阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林（病毒唑）等，這類藥通常副作用較多[2]。山銀花為灰氈毛忍冬（Loniceraemacranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（LonicerahypoglaucaMiq.）、華南忍冬（LoniceraconfusaDC.）或黃褐毛忍冬（Lonicerae fuluotomentosaHsuetS.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花[3]，具有抗炎、抗菌[4]、抗病毒、抗氧化[5]、抗動脈粥樣硬化[6]等作用，其因清熱解毒、涼散風熱之功效而被臨床廣泛應用。有研究表明，山銀花中酚酸類成分及綠原酸類提取物具有抗病毒活性[7-9]，咖啡?？鼘幩犷惢衔锞哂锌购粑啦《靖腥咀饔肹10]，黃酮提取物具有體外抗偽狂犬病毒的作用[11]。目前，尚未見山銀花體外抗甲型H1N1流感病毒（簡稱“H1N1病毒”）作用的研究報道，故本研究擬對山銀花水提物（簡稱“SYHW”）的體外抗H1N1病毒的作用進行研究，為其抗病毒應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BX43倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CFM-300E熒光顯微鏡（上海萬衡精密儀器有限公司）；Multiskan-FC酶標儀（美國Thermo公司）；TDZ4-WS低速離心機（上海盧湘離心機儀器有限公司）；Gallios流式細胞儀（美國Beckman公司）。

1.2 藥材與試劑

山銀花采摘于貴州省綏陽縣，經遵義醫學院生藥學教研室主任楊建文教授鑒定為灰氈毛忍冬（Lonicerae macranthoidesHard.-Mazz.）的干燥花蕾；RPMI1640培養基（上海立菲生物技術有限公司，批號：AAK208935）；胰蛋白酶、MTT、AnnexinⅤ細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：1030E042、1028D051、2015D420）。

1.3 細胞和病毒

犬腎小管上皮細胞（MDCK細胞）、H1N1病毒及9～10日齡雞胚均由遵義醫學院微生物與免疫學教研室提供。

2 方法

2.1 SYHW的制備

稱取山銀花500g，加10倍量水煎煮1.5h，過濾；濾渣加8倍量水煎煮1h，過濾；合并2次濾液，濃縮至500 mL，得質量濃度為1g/mL（以生藥計）的SYHW。

2.2 H1N1病毒的傳代增殖

選擇9～10日齡健康雞胚，將0.2mLH1N1病毒液注入尿囊腔內，48h后，收集尿囊液。按照文獻[12]中方法，將H1N1病毒液進行倍比稀釋，測得其凝血效價為1∶1280。

2.3 H1N1病毒對MDCK細胞的毒性作用測定

將生長旺盛的MDCK細胞消化成單個細胞懸液，按2×104個/孔接種于96孔板中，每孔100μL，在37、5% CO2培養箱中培養24h。待細胞長滿單層后，棄上清，然后將凝血效價為1∶1280的病毒液用維持液2（含0.02%胰酶的RPMI1640培養基）倍比稀釋10～1010倍后分別加入培養孔中，每個濃度重復10孔，每孔100μL；同時設正常對照組（不加病毒，只加維持液2）。放入培養箱中感染1.5h后，小心吸棄各孔病毒液，換用維持液1（含2%胎牛血清的RPMI1640培養基）繼續培養72h。倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，并記錄病變程度及孔數，計算被感染細胞比例，根據Karber公式計算病毒的半數組織培養感染劑量（TCID50），以病毒的100TCID50來進行后續研究。

2.4 SYHW對MDCK細胞的毒性作用測定

將生長旺盛的MDCK細胞消化成單個細胞懸液后，按1×104個/孔接種于96孔板中，每孔100μL，置于37、5%CO2培養箱中培養24h。棄上清，加入質量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL的SYHW，每個質量濃度重復10孔，每孔100 μL；并設置正常細胞組（不加藥物）。繼續培養24h后，棄上清，每孔加2滴維持液1和10μLMTT溶液，置于37、5%CO2培養箱中繼續培養4h。棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩均勻后，在酶標儀上（測定波長為492nm）測定各孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率[13]：細胞存活率（%）＝給藥組平均OD值/正常細胞組平均OD值×100%，找出SYHW的最大無毒濃度。

2.5 SYHW體外抗H1N1病毒作用測定

將生長旺盛的MDCK細胞消化成單個細胞懸液后，按1×104個/孔接種于96孔板中，于37、5%CO2培養箱中培養24h后，將試驗分為正常細胞組、病毒對照組和SYHW的預防給藥、治療給藥、直接殺滅給藥組，每組均重復6孔，再設1個空白孔。正常細胞組（每個給藥組均平行設置）：不用病毒進行感染也不加入藥物。病毒對照組（每個給藥組均平行設置）：加入100TCID50的H1N1病毒液（100μL/孔），于37、5%CO2培養箱中培養。SYHW預防給藥組：先將最大無毒濃度的SYHW加入培養孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培養箱中培養24h后棄去培養液；然后再加入100TCID50的H1N1病毒液（100μL/孔），于37、5%CO2培養箱中感染1.5 h；然后再換為相應質量濃度的SYHW，培養至病毒對照組MDCK細胞出現最大程度病變為止[12-13]。SYHW治療給藥組：先將100TCID50的病毒液加入細胞培養孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培養箱中感染1.5h后棄去病毒液；然后再加入最大無毒濃度SYHW（100μL/孔），繼續培養至病毒對照組MDCK細胞出現最大程度病變為止。SYHW直接殺滅給藥組：先將最大無毒濃度SYHW與100TCID50H1N1病毒液按1∶1混合后加入培養孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培養箱中培養1.5h，棄去混合液；然后加入維持液1繼續培養至病毒對照組MDCK細胞出現最大程度病變為止。采用MTT法測定各孔OD值（測定波長為492nm），計算SYHW的抗病毒有效率（ER）[14]：ER（%）＝（給藥組平均OD值－病毒對照組平均OD值）（/正常細胞組平均OD值－病毒對照組平均OD值）×100%。

2.6 SYHW對H1N1病毒感染MDCK細胞周期的影響

將生長旺盛的MDCK細胞按1×104個/孔接種于6孔板中，于37、5%CO2培養箱中培養過夜，分別設置正常細胞組、病毒對照組和SYHW的治療給藥、直接殺滅給藥組，每個濃度重復3孔，處理方法同“2.5”項。培養結束后收集上清液，用胰酶（未加乙二胺四乙酸）消化細胞。將細胞懸液及上清液混合，離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，然后將細胞滴入70%冷乙醇中固定，－20冰箱保存備檢。檢測前取出樣品離心，用冷PBS洗滌3次后，按照1×106個細胞加1m L碘化丙啶（PI）染液，避光染色至少30min，流式細胞儀上機檢測。用M cycle軟件檢測細胞周期分布，計算細胞增殖指數（PI，%）：S期和G2/M期細胞數占細胞總數的百分比。

2.7 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細胞凋亡的影響

將生長旺盛的MDCK細胞按1×104個/孔接種于6孔板中，于37、5%CO2培養箱中培養過夜，按照“2.6”項下分組、給藥。結束培養后收集上清液，并用胰酶（未加乙二胺四乙酸）消化細胞，將細胞懸液及上清液混合，離心，PBS洗2次，根據AnnexinⅤ細胞凋亡檢測試劑盒操作，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.8 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 H 1N1病毒對MDCK細胞的毒性作用測定結果

H1N1病毒感染MDCK細胞后細胞出現皺縮、變圓、壁增厚、脫落以及折光性增強等細胞病變現象，根據Karber公式計算病毒的TCID50為1.26×10－9，100 TCID50為1.26×10－7。MDCK細胞感染H1N1病毒后細胞形態的變化見圖1。

圖1 MDCK細胞感染H1N1病毒后細胞形態的變化Fig 1 Cellm orphology changes of MDCK cells after infected by H 1N1 virus

3.2 SYHW對MDCK細胞的毒性作用測定結果

當SYHW質量濃度≥100μg/m L時，SYHW組的OD值與正常細胞組比較差異有統計學意義（P＜0.05），表明當SYHW質量濃度≥100μg/m L時對細胞有明顯毒性。故其最大無毒濃度為50μg/m L，此時細胞存活率為91.3%，結果詳見表1。

表1 SYHW對MDCK細胞的毒性作用測定結果（n＝10）Tab 1 Determ ination results of toxic effect of SYHW on MDCK cells（n＝10）

3.3 SYHW抗H 1N1病毒作用測定結果

病毒對照組OD值較正常細胞組OD值顯著降低（P＜0.05）；SYHW治療給藥后細胞OD值顯著升高（P＜0.05），SYHW治療給藥組、直接殺滅給藥組ER分別為80.3%、52.7%，SYHW對H1N1病毒感染無預防作用，結果詳見表2。

表2 SYHW抗H 1N1病毒作用測定結果（n＝6）Tab 2 Determ ination resultsof anti-H1N1 viruseffect of SYHW（n＝6）

3.4 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細胞周期的影響情況

與正常細胞組比較，病毒對照組細胞PI值顯著降低（P＜0.05）；與病毒對照組比較，SYHW直接殺滅給藥組細胞PI值顯著升高（P＜0.05），結果詳見表3。

3.5 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細胞凋亡的影響情況

與正常細胞組比較，病毒對照組細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。與病毒對照組比較，SYHW治療給藥組細胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），然而晚期凋亡率繼續升高（P＜0.05）；SYHW直接殺滅給藥組細胞的早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），晚期凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05），結果詳見表4。

表3 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細胞周期的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of SYHW on cell cycle of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

表3 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細胞周期的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of SYHW on cell cycle of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

注：與正常細胞組比較，＊P＜0.05；與病毒對照組比較，#P＜0.05Note：vs.normal cell group，＊P＜0.05；vs.virus control group，#P＜0.05

PI，% 60.85±0.03 39.07±0.03＊45.77±0.03 50.60±0.02#組別正常細胞組病毒對照組SYHW治療給藥組SYHW直接殺滅給藥組質量濃度，μg/mL細胞比例，% S 005 0 50 G0/G139.00±3.00 60.95±2.51 54.24±3.07 49.41±1.83 28.44±3.06 30.57±5.38 18.66±6.61 30.23±0.66 G2/M 32.41±3.01 8.50±5.69 27.11±4.52 20.37±1.30

表4 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細胞凋亡的影響（±s，n＝3）Tab 4 Effects of SYHW on apoptosis of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

表4 SYHW對H 1N1病毒感染MDCK細胞凋亡的影響（±s，n＝3）Tab 4 Effects of SYHW on apoptosis of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

注：與正常細胞組比較，＊P＜0.05；與病毒對照組比較，#P＜0.05Note：vs.normal cell group，＊P＜0.05；vs.virus control group，#P＜0.05

晚期凋亡率，% 0.23±0.15 0.30±0.26＊4.30±0.17#1.90±2.90組別正常細胞組病毒對照組SYHW治療給藥組SYHW直接殺滅給藥組質量濃度，μg/mL 005 0 50早期凋亡率，% 6.73±1.24 41.70±2.21＊17.37±2.37#27.80±6.04#

4 討論

依據2015年版《中國藥典》（一部）規定，山銀花臨床用量為6～15 g[3]，以人體平均體液50 L計算，得到臨床實際用藥濃度。以此為參考，設置系列等比濃度篩選SYHW最大無毒濃度進行試驗。結果顯示，細胞耐受的最大無毒濃度（50μg/m L）遠低于人體耐受的最大無毒濃度（300μg/m L）。本研究采用3種給藥方式考察SYHW的體外抗病毒作用，其中直接殺滅給藥組設置的目的是確定SYHW直接作用于H1N1病毒后是否具有抑制作用，同時設置SYHW預防給藥組和SYHW治療給藥組進一步明確SYHW抗H1N1病毒的作用是在細胞內還是細胞外。

抗病毒試驗結果顯示，SYHW具有直接抑制H1N1病毒活性的作用（ER＝52.7%），且SYHW治療給藥組ER較病毒對照組顯著降低，這提示SYHW在細胞內抗H1N1病毒療效較好，預示其可能對H1N1病毒有一定的治療作用，而無預防作用。故在細胞周期及細胞凋亡試驗中也只采用SYHW治療給藥和直接殺滅給藥兩種給藥方式進行試驗。結果顯示，H1N1病毒感染MDCK細胞后將細胞阻滯于G0/G1期，阻礙細胞正常生長，且會引起細胞早期凋亡。SYHW作用于被H1N1病毒感染的MDCK細胞后，可逆轉流感病毒引起的G0/G1期細胞阻滯，促進已被H1N1病毒感染的MDCK細胞進入S期，從而促進細胞有絲分裂，提高PI值。

綜上所述，SYHW具有體外抗H1N1病毒的作用，且以治療給藥和直接殺滅給藥抗病毒作用較好。但山銀花化學成分較多，其發揮抗病毒作用的有效成分及作用機制還有待進一步研究。

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Study on the Anti-influenza A Virus H 1N1 Effect of Aqueous Extraction of Lonicerae Flos in vitro

CHEN Ling1，ZHOU Yanmeng2，OU Shuiping3，REN Li4（1.Drug Clinical Trial Institution of the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi563000，China；2.M icrobiology and Immunology Laboratory of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi563006，China；3.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi 563000，China；4.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563006，China）

OBJECTIVE：To investigate the effect of aqueous extraction of Lonicerae Flos（SYHW）on anti-influenza A virus H1N1（H1N1 virus）in vitro.METHODS：Using Madin-Darby canine kid ney（MDCK）cells cultured in vitro by H1N1 virus，half of the tissue culture infection dose（TCID50）was calculated.Culturing MDCK cells for 24 h w ith differentmass concentrations of SYHW，themaximum non-toxic concentration was investigated.And then test was divided into normal cell group，virus control group，SYHW preventive adm inistration group，therapeutic adm inistration group and direct killing group（given SYHW of maximum non-toxic concentration，infecting cells by 100 TCID50H1N1 virus），and antiviral effective rate（ER）of SYHW was determ ined.Testwas divided into normal cell group，virus control group，SYHW therapeutic group and direct killing group（the same adm inistration and infection as above），changes of cell proliferation index（PI）and cell apoptosis rate were respectively determ ined.RESULTS：100 TCID50of H1N1 virus was 1.26×10－7，and themaximum non-toxic concentration of SYHW on MDCK cells was 50μg/m L（cell survival rate was 91.3%）.ERs of preventive administration group，therapeutic administration group and direct killing group were 0，80.3%and 52.7%，respectively.Compared w ith normal cell group，PI value in virus control group was significantly reduced（P＜0.05），early and late apoptotic rates were significantly increased（P＜0.05）.Compared w ith virus control group，PI value in directly killing group was significantly increased（P＜0.05），and early apoptotic rate was significantly reduced（P＜0.05）；early apoptotic rates in therapeutic adm inistration group were significantly reduced（P＜0.05）.CONCLUSIONS：SYHW shows anti-H1N1 virus effect in vitro，therapeutic adm inistration and directly killing are preferred in antiviral effect.

Lonicerae Flos；Aqueous extraction；MDCK cell；Influenza A virus H1N1；in vitro

R285

A

1001-0408（2017）16-2194-04

2016-09-09

2017-04-17）

遵義市科技計劃項目（No.遵市科合社字〔2011〕26號）

＊主任藥師，碩士生導師。研究方向：藥劑學、藥事管理學。電話：0851-8608210。E-mail：1551062041@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.09