清腦片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用Δ

黎丹東，謝國(guó)旗，高延玲，蘇 峰，王希東，李 艷，張正臣（1.解放軍第71醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河南新鄉(xiāng)5000；.解放軍第71醫(yī)院腦外科，河南新鄉(xiāng) 5000；.解放軍第71醫(yī)院感染科，河南新鄉(xiāng) 5000；.解放軍第71醫(yī)院藥械科，河南新鄉(xiāng) 5000）

清腦片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用Δ

黎丹東1＊，謝國(guó)旗2#，高延玲2，蘇 峰3，王希東4，李 艷4，張正臣4（1.解放軍第371醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河南新鄉(xiāng)453000；2.解放軍第371醫(yī)院腦外科，河南新鄉(xiāng) 453000；3.解放軍第371醫(yī)院感染科，河南新鄉(xiāng) 453000；4.解放軍第371醫(yī)院藥械科，河南新鄉(xiāng) 453000）

目的：研究清腦片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用。方法：取大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦絡(luò)通膠囊組（陽(yáng)性對(duì)照，0.05 g/kg）和清腦片高、中、低劑量組（1.52、0.76、0.38 g/kg），每組10只。各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠ig等體積羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥1 h后，除假手術(shù)組外其余各組大鼠均采用線栓法制作腦缺血再灌注損傷模型。于缺血再灌注22 h后，進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分，觀察腦組織海馬區(qū)病理學(xué)變化，測(cè)定腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷（ATP）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺失（評(píng)分降低）以及海馬區(qū)神經(jīng)元稀疏、排列不規(guī)則等病理改變；腦組織中ATP、SOD水平降低（P＜0.01），LDH、TNF-α水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，清腦片各劑量組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分升高（P＜0.05），病理?yè)p傷改善；除清腦片低劑量組外，其余各給藥組大鼠腦組織中各指標(biāo)也顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：清腦片可升高腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織中ATP、SOD水平，降低LDH、TNF-α水平，并明顯改善大鼠病理?yè)p傷。

清腦片；腦缺血再灌注損傷；大鼠；預(yù)防作用

腦血管疾病已成為我國(guó)居民死亡的第二大原因，其中缺血性腦血管疾病約占腦血管疾病的75%[1]。缺血性腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制是由于腦組織血流量突然中斷或減少，當(dāng)缺血區(qū)恢復(fù)供血后卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦損傷，稱之為缺血性腦損傷[2]。如何有效地防治缺血性腦損傷已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題。缺血性腦損傷在中醫(yī)體系中歸屬于“中風(fēng)”范疇，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點(diǎn)[3]，中醫(yī)理論中認(rèn)為缺血性腦中風(fēng)以氣虛血瘀最為常見[4]。

清腦片是解放軍第371醫(yī)院的院內(nèi)協(xié)定處方，由白芷、川芎、當(dāng)歸、鉤藤、細(xì)辛等7味中藥材組成，具有活血、行氣通竅、止痛、清利頭目的功效，臨床上主要用于頭痛、頭暈、腦震蕩后遺癥等的治療，安全性較高[5]。在本研究中，筆者擬通過測(cè)定腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷（ATP）、乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平并結(jié)合腦組織海馬區(qū)病理變化，考察清腦片對(duì)缺血性腦損傷的作用，為其應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 儀器

AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV1000紫外-可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；CYT3MFVDG細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；BX61電動(dòng)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

清腦片（本院自制，批號(hào)：20141125，規(guī)格：0.3 g/片，生藥量為0.48 g/片）；腦絡(luò)通膠囊（河南輔仁堂制藥有限公司，批號(hào)：150309，規(guī)格：0.5 g/粒）；ATP、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20160107、20160118）；大鼠TNF-α、LDH酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號(hào)均為20151201A）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)W istar大鼠，♂，體質(zhì)量為250～280 g，購(gòu)自濟(jì)南悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將80只大鼠隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組（羧甲基纖維素鈉）、模型組（羧甲基纖維素鈉）、腦絡(luò)通膠囊組（陽(yáng)性對(duì)照，0.05 g/kg，根據(jù)臨床用量的10倍劑量換算而得）及清腦片高、中、低劑量組（1.52、0.76、0.38mg/kg，分別根據(jù)臨床用量的20、10、5倍劑量換算而得），其中假手術(shù)組10只大鼠，其余各組均為14只。正常飼養(yǎng)3 d后，每天ig給藥1次，1m L/100 g，連續(xù)5 d。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥1 h后ip 10%水合氯醛（0.35 m L/100 g）麻醉大鼠，頸部正中偏左切口，逐層分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈距離分叉5mm處剪0.2 mm小口，將線栓插入，經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，向上深入至分叉以上18～20mm，直至有阻力，即阻斷大腦中動(dòng)脈入口處，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近端，2 h后輕輕抽出栓線；假手術(shù)組大鼠只暴露左側(cè)血管不作插線處理[6]。所有大鼠只栓塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈，復(fù)制腦缺血再灌注損傷模型。模型大鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)霍納綜合征及對(duì)側(cè)上肢重于下肢的癱瘓癥狀視為造模成功[7]。

2.2 神經(jīng)功能缺失評(píng)分

大鼠再灌注22 h后，采用Zealonga法[8]對(duì)其神經(jīng)功能缺失進(jìn)行評(píng)分：無神經(jīng)功能缺失癥狀、活動(dòng)正常者，計(jì)0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪者，計(jì)1分；爬行時(shí)出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈者，計(jì)2分；行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒者，計(jì)3分；不能自發(fā)行走、意識(shí)喪失者，計(jì)4分；死亡者，計(jì)5分。評(píng)分為0分或4分以上者均剔除，剔除后隨機(jī)補(bǔ)充大鼠保證每組10只。

2.3 腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察

處死大鼠，取出腦組織，用4%緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋腦組織并制成4μm厚的切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變[9]：“-”表示海馬區(qū)結(jié)構(gòu)正常、神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；“+”表示腦組織海馬區(qū)水腫、神經(jīng)元水腫、少數(shù)神經(jīng)元壞死；“++”表示腦組織海馬區(qū)水腫、成片神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬面積的1/3以內(nèi)；“+++”表示腦組織海馬區(qū)水腫、成片神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬面積的1/3以上。

2.4 腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測(cè)定

制備10%的腦組織勻漿，按相應(yīng)試劑盒說明書操作，測(cè)定ATP、SOD、LDH、TNF-α水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games-Howell檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用Ridit檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分結(jié)果

與假手術(shù)組（評(píng)分為0分）比較，模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能缺失評(píng)分[（2.50±0.97）分]顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦絡(luò)通膠囊組和清腦片高、中、低劑量組大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀均顯著改善，神經(jīng)功能缺失評(píng)分[依次為（1.40± 0.52）、（1.50±0.53）、（1.70±0.48）、（1.70±0.67）分，n＝10]均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

3.2 腦組織海馬區(qū)病理觀察結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元稀疏、排列不規(guī)則等，表現(xiàn)出顯著病變（P＜0.01）；與模型組比較，腦絡(luò)通膠囊組和清腦片高、中劑量組大鼠腦組織海馬區(qū)病變顯著改善（P＜0.05或P＜0.01）。病理分級(jí)見表1，病理切片見圖1。

表1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)病理改變的測(cè)定結(jié)果（n＝10，只）Tab 1 Results of pathological changes of hippocampus of brain tissue of rats in each group（n＝10，case）

圖1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)病理切片圖（HE，×400）Fig 1 Pathological pictures of hippocam pus of brain tissueof rats in each group（HE，×400）

3.3 腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中ATP、SOD水平顯著降低（P＜0.01），LDH、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦絡(luò)通膠囊組和清腦片高、中劑量組大鼠腦組織中上述指標(biāo)顯著改善（P＜0.05或P＜0.01），清腦片低劑量組大鼠上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Results of ATP，SOD，LDH，TNF-αlevels in brain tissueof rats in each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠腦組織中ATP、SOD、LDH、TNF-α水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Results of ATP，SOD，LDH，TNF-αlevels in brain tissueof rats in each group（±s，n＝10）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α，pg/mL 20.23±3.00 43.90±5.35＊＊29.67±5.38##29.47±3.72##34.94±2.76##43.82±3.67組別假手術(shù)組模型組腦絡(luò)通膠囊組清腦片高劑量組清腦片中劑量組清腦片低劑量組ATP，μmol/gprot 865.99±71.44 620.57±81.05＊＊791.42±91.59##716.34±74.91#710.03±85.02#675.13±72.98 SOD，U/mgprot 190.45±24.74 154.74±21.06＊＊182.10±21.25#174.85±19.06#172.16±15.49#166.33±18.36 LDH，U/L 1.20±0.22 1.80±0.30＊＊1.31±0.22##1.32±0.22##1.49±0.29#1.62±0.17

4 討論

清腦片中的白芷，味辛，性溫，具有通竅止痛、散風(fēng)除濕的作用，為君藥。川芎，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效；當(dāng)歸，性溫，味辛，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血、活血、止痛的作用[10]；鉤藤，性微寒，味甘，具有息風(fēng)止痙、清熱平肝之功效[11]；細(xì)辛，性溫，味辛，具有祛風(fēng)散寒、通竅止痛的功效，4藥合用共為臣藥。龍骨，性平，味甘、澀，歸心、肝、腎經(jīng)，具有鎮(zhèn)驚安神、平肝潛陽(yáng)、收斂固澀的作用，為佐藥。薄荷，性涼，味辛，具有疏散風(fēng)熱、清利頭目之功效，為使藥。諸藥合用，具有活血、行氣、通竅止痛、清利頭目之作用。腦絡(luò)通膠囊為非處方心腦血管類藥品，具有擴(kuò)張血管、增加腦血流量的作用，臨床用于各種腦血管疾病引起的頭痛、眩暈、半身不遂、肢體發(fā)麻、神疲乏力等癥，且臨床效果明顯，故在本研究中以此為陽(yáng)性藥物。

腦組織中ATP含量不足會(huì)導(dǎo)致組成細(xì)胞架的蛋白和脂質(zhì)降解，磷脂降解的產(chǎn)物（如溶血磷脂、自由脂肪酸和花生四烯酸等）可進(jìn)一步觸發(fā)或發(fā)生氧化代謝反應(yīng)而加重腦損傷[12]。LDH水平異常升高，一方面抑制了線粒體的呼吸功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭，使腦的能量供給顯著減少；另一方面促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載和自由基生成，導(dǎo)致廣泛的腦損傷。SOD作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，可與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化酶催化轉(zhuǎn)變成水，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[13]。TNF-α被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)介質(zhì)，在炎癥網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵作用，在腦缺血再灌注早期，TNF-α合成或分泌的增加是腦梗死形成的重要原因[14]。觀察腦神經(jīng)細(xì)胞最可靠的方法是形態(tài)學(xué)，可發(fā)現(xiàn)缺血會(huì)造成大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，表現(xiàn)為退化性的改變，同時(shí)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)也減少。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，高、中、低劑量清腦片均能夠明顯改善大鼠神經(jīng)缺失癥狀，減輕腦組織海馬區(qū)病理?yè)p傷；高、中劑量清腦片均可明顯升高腦損傷大鼠腦組織中ATP、SOD水平，降低腦損傷大鼠腦組織中LDH、TNF-α水平。

綜上所述，清腦片能有效預(yù)防大鼠腦缺血再灌注損傷，其中以高、中劑量作用效果較好，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Preventive Effect of Qingnao Tablet on Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury in Rats

LI Dandong1，XIE Guoqi2，GAO Yanling2，SU Feng3，WANG Xidong4，LIYan4，ZHANG Zhengchen4（1.Dept.of Medical Service，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China；2.Dept.of Cerebral Surgery，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China；3.Dept.of Infectious Disease，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China；4.Dept.of Instrument，No.371 Hospital of PLA，Henan Xinxiang 453000，China）

OBJECTIVE：To study the preventive effect of Qingnao tablet on cerebral ischem ia-reperfusion injury in rats. METHODS：Rats were random ly divided into sham operation group，model group，Naoluotong capsule group（positive control，0.05 g/kg），Qingnao tablet high-dose，medium-dose，low-dose groups（1.52，0.76，0.38 g/kg），10 in each group.Rats in all adm inistration groupswere intragastrically given relevantmedicines，rats in sham operation group and model group were intragastrically given equal volume of sodium carboxymethylcellulose solution，once a day，for 5 d.After 1 h of last administration，all rats were induced for cerebral ischemia-reperfusion injury model by suture-occluded method except for sham operation group.After 22 h of ischemia-reperfusion，neurological function deficit scoring was conducted；the pathological changes of the hippocampuswere observed；superoxide dismutase（SOD），adenosine triphosphate（ATP），lactate dehydrogenase（LDH），tumor necrosis factorα（TNF-α）levels in brain tissue weremeasured.RESULTS：Compared w ith sham operation group，rats in model group appeared different degrees of neurological deficits（score declined），sparse neurons，irregularly arranged in hippocampus aswell as other pathological changes；ATP，SOD levels in brain tissue were decreased（P＜0.01），LDH，TNF-αlevelswere increased（P＜0.01）.Compared w ith model group，neurological function deficit scores in Qingnao tablet doses groups were increased（P＜0.05），neurological deficits were improved.Except for sham operation group，brain tissue indexes in other adm inistration groups were significantly improved（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Qingnao tablet can increase ATP and SOD levels in brain tissue homogenate of model ratsw ith cerebral ischemia-reperfusion，decrease LDH and TNF-αlevels，and obviously improve rats’cerebral ischem ia-reperfusion injury.

Qingnao tablet；Cerebral ischemia-reperfusion injury；Rat；Preventive effect

R965.1

A

1001-0408（2017）16-2198-04

2016-10-14

2017-01-10）

（編輯：林 靜）

河南新鄉(xiāng)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.CXGG16054）

＊主治醫(yī)師。研究方向：神經(jīng)外科、藥理學(xué)。電話：0373-5193515。E-mail：lidandong001@163.com

#通信作者：主任醫(yī)師，碩士。研究方向：神經(jīng)內(nèi)科、藥理學(xué)。電話：0373-3541018。E-mail：xiegq152@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.10