血脂平膠囊對高血脂模型金黃地鼠血脂水平的影響及機制研究

申 強，張海晶，楊明華，孫曉波，孫桂波#（.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱50076；.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 0093）

血脂平膠囊對高血脂模型金黃地鼠血脂水平的影響及機制研究

申 強1＊，張海晶2，楊明華1，孫曉波2，孫桂波2#（1.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱150076；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193）

目的：研究血脂平膠囊對高血脂模型金黃地鼠血脂水平的影響及其可能機制。方法：將金黃地鼠隨機分為正常對照組、模型組、阿托伐他汀組（3mg/kg）、聯(lián)用組（血脂平膠囊1.3 g/kg+阿托伐他汀1.5mg/kg）和血脂平膠囊低、中、高劑量組（血脂平膠囊1.3、2.6、5.2 g/kg），每組10只。正常對照組地鼠給予普通飼料，其他組地鼠給予高脂飼料建立高血脂模型，2周后同時ig給予相應藥物，正常對照組和模型組地鼠ig等體積的蒸餾水，每日1次，連續(xù)給藥4周。末次給藥后，檢測各組地鼠血脂指標[總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、游離脂肪酸（FFA）]，肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因（PPAR-α、CYP7A1、ACOX、SREBP-1c、ACC1）mRNA及蛋白表達。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組地鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA含量增加，HDL-C含量降低，PPAR-α、CYP7A1、ACOXmRNA及蛋白表達減弱，SREBP-1c、ACC1mRNA及蛋白表達增強（P＜0.05）。與模型組比較，血脂平膠囊高劑量組、阿托伐他汀組和聯(lián)用組地鼠上述指標均明顯改善（血脂平高劑量組HDL-C除外）（P＜0.05）；血脂平膠囊中劑量組地鼠TC、TG、FFA含量和PPAR-α、CYP7A1、ACOX、ACC1mRNA及CYP7A1、SREBP-1c、ACC1蛋白表達均明顯改善（P＜0.05）；血脂平膠囊低劑量組地鼠TC、TG含量和PPAR-αmRNA及CYP7A1、SREBP-1c蛋白表達均明顯改善（P＜0.05）。結(jié)論：血脂平膠囊具有降血脂作用，其機制可能與激活PPAR-α和抑制SREBP-1c信號通路有關(guān)。

血脂平膠囊；高血脂；降血脂；作用機制；金黃地鼠

由于不良生活方式的影響，在中國，高脂血癥（Hyperlipidem ia，HLP）已成為一種常見的代謝性疾病。該疾病特點為脂代謝異常，包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）異常升高和高密度脂蛋白（HDL）顯著降低[1]。最新的流行病學研究發(fā)現(xiàn)，中國有30萬年齡超過20歲的成年人TC高于5.18mmol/L，約20萬人低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）高于3.37mmol/L[2]。HLP已被公認為動脈粥樣硬化和冠心病的重要誘因[3-4]。降低LDL可有效減少HLP的發(fā)生[5]，因此，降血脂對于治療血管疾病起著至關(guān)重要的作用。

血脂平膠囊由刺梨、徐長卿、絞股藍、山楂等常用中藥組成，具有健脾除濕、消食化滯的功效，臨床用于HLP的治療。研究顯示，血脂平膠囊可顯著降低血脂，且具有促進血液循環(huán)、增強抗動脈粥樣硬化的作用[6]。但是關(guān)于血脂平的降血脂機制尚未見文獻報道，該藥降低血脂的分子機制尚不明確。因此，本文通過研究血脂平膠囊對高血脂模型金黃地鼠血脂水平的影響及其作用機制，為血脂平膠囊對HLP的調(diào)節(jié)作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MQX200型酶標儀（帝肯上海貿(mào)易有限公司）；AU480型全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特株式會社）；A101439型電泳儀、CFX96型實時定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀和ChemiDOCTM型凝膠成像儀（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品上海有限公司）。

1.2 藥品與試劑

血脂平膠囊[朗致集團貴州太和制藥有限公司，批號：20150401，規(guī)格：0.3 g/粒，相當于1.2 g（生藥）/粒]；阿托伐他汀鈣片（愛爾蘭Pfizer公司，批號：L46448，規(guī)格：每片20mg）；TC（批號：150721）、TG（批號：150821）、HDL-C（批號：150701）、LDL-C（批號：150781）檢測試劑盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；游離脂肪酸（FFA）超敏測定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：E1001）；總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR試劑盒，（寶生物工程大連有限公司）；膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）抗體（美國 Abcam公司，批號：ab140483）；過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）抗體、乙酰輔酶A羧化酶（ACC1）抗體（美國Proteintech公司，批號：15540-1、21923-1）；膽固醇7-羥化酶（CYP7A1）抗體、過氧化物酶酰基輔酶A氧化酶（ACOX）抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-25536、sc-98499）；β-肌動蛋白（β-actin）、β-微管蛋白（β-tubulin）和羊抗鼠、羊抗兔二抗（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW 0096M、CW 0098M、CW 0102M、CW 0103M）。

1.3 動物與飼料

金黃地鼠70只，♂，6～8周齡，體質(zhì)量90～110 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK（京）2012-0001。金黃地鼠分籠養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所SPF級動物房內(nèi)，室溫為22～25、濕度為50%～70%，晝夜12 h交替飼養(yǎng)，自由飲水及攝食。高脂飼料：15%豬油、0.2%膽固醇、84.8%基礎(chǔ)飼料，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為京飼證（2014）06057。

2 方法

2.1 分組與給藥

金黃地鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組、模型組、阿托伐他汀組（3mg/kg）、聯(lián)用組（血脂平膠囊1.3 g/kg+阿托伐他汀1.5mg/kg）和血脂平膠囊低、中、高劑量組（血脂平膠囊1.3、2.6、5.2 g/kg），每組10只。正常對照組地鼠給予普通飼料，其余組地鼠給予高脂飼料，2周后同時ig相應藥物，正常對照組和模型組地鼠ig等體積的蒸餾水，每日1次，連續(xù)4周。

2.2 血清中血脂指標測定

末次給藥后，地鼠禁食不禁水12 h，眼眶靜脈取血，4 、3 000 r/m in（離心半徑6.5 cm）離心10m in，取上清。采用全自動生化分析儀檢測各組地鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測FFA含量，試驗按試劑盒要求操作。

2.3 肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因測定

使用Primer 5軟件設計基因引物，Oligo7軟件評價引物。PCR引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。提取各組地鼠肝組織總RNA，測定RNA濃度及260、280 nm波長處吸光度比值（A260/A280），并將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置PCR反應體系，SYBR Green RTPCR法檢測各組地鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1c、PPAR-α、ACC1、CYP7A1、ACOX mRNA表達。RT-PCR的反應條件：95預變性30 s，兩步法進行擴增，即955 s、6030 s，40個循環(huán)。RT-PCR儀自動繪制融解曲線。以目標基因與內(nèi)參（β-actin）的比值評價相關(guān)基因的表達。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 PCR primer sequence

2.4 肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白測定

提取肝組織中總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定其濃度后制樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目標蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉后，將膜先后與相應的一抗、二抗室溫孵育，并洗去未結(jié)合的抗體，增強化學發(fā)光試劑（ECL）曝光。檢測各組地鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白SREBP-1c、PPAR-α、ACC1、CYP7A1、ACOX的表達，分別以目標蛋白與內(nèi)參（β-actin和β-tubulin）的比值評價蛋白表達。

3 結(jié)果

3.1 血脂指標測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組地鼠血清中TC、TG、LDL-C水平和FFA含量均增加（P＜0.05或P＜0.01），表明實驗期間HLP模型造模成功。與模型組比較，血脂平膠囊高劑量組、阿托伐他汀組和聯(lián)用組地鼠上述指標（血脂平膠囊高劑量組HDL-C除外）均明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）；血脂平膠囊中劑量組地鼠血清中TC、TG、FFA均降低（P＜0.01）；血脂平膠囊低劑量組地鼠TC、TG均降低（P＜0.05）。各組地鼠血脂指標測定結(jié)果見表2。

表2 各組地鼠血脂指標測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determ ination results of blood lipid indexes in each group ofham ster（±s，n＝10）

表2 各組地鼠血脂指標測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determ ination results of blood lipid indexes in each group ofham ster（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

正常對照組模型組血脂平膠囊低劑量組血脂平膠囊中劑量組血脂平膠囊高劑量組阿托伐他汀組聯(lián)用組42±6.2 82±6.0＊＊75±4.0 68±5.0##60±5.0##58±5.3##60±5.6##4.15±0.83 10.44±1.98＊＊8.52±1.05#7.44±0.67##6.78±1.22##6.74±1.21##6.27±0.54##4.10±1.45 10.79±1.77＊＊9.06±1.48#8.84±1.08##7.89±1.89##3.27±1.24##3.97±0.88##2.18±0.15 2.02±0.15＊2.48±0.23 2.47±0.38 2.47±0.31 3.28±0.50##3.24±0.65##1.46±0.43 4.24±0.85＊＊3.46±0.80 3.55±0.60 2.48±0.57##3.13±0.65##2.78±0.41##

3.2 肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組地鼠肝組織中PPAR-α、CYP7A1、ACOX mRNA表達減弱，SREBP-1c、ACC1 mRNA表達增強（P＜0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組、聯(lián)用組和血脂平膠囊中、高劑量組地鼠上述指標（血脂平膠囊中劑量組SREBP-1c除外）均明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）。各組地鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達的測定結(jié)果見表3。

表3 各組地鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Determ ination resultsof lipidmetabolism related genes m RNA expressions in liver tissue in each group of ham ster（±s，n＝10）

表3 各組地鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Determ ination resultsof lipidmetabolism related genes m RNA expressions in liver tissue in each group of ham ster（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組血脂平膠囊低劑量組血脂平膠囊中劑量組血脂平膠囊高劑量組阿托伐他汀組聯(lián)用組ACOX 1 0.58±0.10＊＊0.53±0.04 0.83±0.13##0.84±0.05##1.05±0.05##0.92±0.09##SREBP-1c 1 1.60±0.10＊＊1.37±0.32 1.40±0.09 1.26±0.23#1.11±0.19##1.22±0.24##PPAR-α 1 0.63±0.07＊＊0.84±0.11#0.88±0.09#1.00±0.15##0.98±0.10##1.03±0.09##ACC1 1 1.43±0.20＊＊1.12±0.15 0.76±0.14##0.76±0.19##0.97±0.15#0.70±0.12##CYP7A1 1 0.59±0.07＊＊0.66±0.10 0.92±0.18##1.00±0.10##1.00±0.10##0.96±0.12##

3.3 肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組地鼠肝組織中PPAR-α、CYP7A1、ACOX蛋白表達減弱，SREBP-1c、ACC1蛋白表達增強（P＜0.01）。與模型組比較，其余各組地鼠肝組織中SREBP-1c、ACC1（血脂平膠囊低劑量組除外）蛋白表達減弱（P＜0.05或P＜0.01），血脂平膠囊高劑量組、阿托伐他汀組和聯(lián)用組地鼠肝組織中PPAR-α、ACOX（聯(lián)用組除外）、CYP7A 1蛋白表達增強（P＜0.05或P＜0.01）。各組地鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的電泳圖見圖1，表達結(jié)果見圖2。

圖1 各組地鼠肝組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的電泳圖Fig 1 Electrophoresis chart of lipid metabolism related protein expressions in liver tissue in each group of ham ster

4 討論

PPAR-α是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）的亞型之一，屬于核受體亞家族，參與調(diào)控FFA轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)氧化和脂蛋白合成組裝等相關(guān)基因的表達[7]。PPAR-α高表達于代謝活躍的組織，研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α可維持正常脂肪酸穩(wěn)態(tài)，預防酒精性脂肪肝的發(fā)生[8]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α通過對其下游基因CYP7A1的調(diào)控，可促進膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化，并通過增強膽汁酸的有效排出而降低血液TC水平[9]。ACOX為PPAR-α調(diào)控的下游基因，是脂肪細胞與脂肪酸的氧化相關(guān)酶，同時也是過氧化酶體內(nèi)β-氧化系統(tǒng)的起始酶[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，血脂平膠囊可通過上調(diào)PPAR-α表達促進其下游基因ACOX1表達，進而調(diào)節(jié)細胞中的脂肪酸代謝，同時促進CYP7A1的mRNA及蛋白表達，起到降低TC的作用。

肝臟脂肪酸從頭合成是體內(nèi)脂質(zhì)合成的重要來源之一，肝細胞自身合成TG的三分之一是通過脂質(zhì)從頭合成途徑的，其余三分之二來自于外源性FFA的合成[11]。SREBP-1c是調(diào)節(jié)脂肪酸和TG合成相關(guān)酶表達的轉(zhuǎn)錄因子[12]。高脂飲食可上調(diào)SREBP-1c，進而使其下游脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACC1高表達，引起肝臟脂質(zhì)合成增多，導致脂肪變性[13-14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血脂平膠囊均通過下調(diào)SREBP-1c表達，而降低其下游的ACC1表達以達到調(diào)節(jié)血脂的目的，且對于ACC1的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于阿托伐他汀。當阿托伐他汀劑量減半與血脂平膠囊合用時，其藥效與阿托伐他汀相當甚至更優(yōu)，還可以降低他汀類藥物長期用藥的不良反應風險。

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

綜上所述，血脂平膠囊具有良好的降血脂作用，其降脂機制可能與激活PPAR-α和抑制SREBP-1c信號通路有關(guān)。而血脂平膠囊具體通過什么分子機制激活PPAR-α與SREBP-1c，有待進一步研究。

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Study on the Effect and M echanism of Xuezhiping Capsu le on Blood Lipid Levels of H igh Blood Lipid M odel Golden Hamsters

SHEN Qiang1，ZHANG Haijing2，YANG M inghua1，SUN Xiaobo2，SUN Guibo2（1.Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2. China Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China）

OBJECTIVE：To study the effect and its possible mechanism of Xuezhiping capsule on blood lipid levels of high blood lipid model golden hamsters.METHODS：Golden hamsterswere random ly divided into normal control group，model group，atorvastatin group（3 mg/kg），combination group（Xuezhiping capsule 1.3 g/kg+atorvastatin 1.5 mg/kg），Xuezhiping capsule lowdose，medium-dose，high-dose groups（Xuezhiping capsule 1.3，2.6，5.2 g/kg），10 in each group.Hamsters in normal control group

normal diet，the other groups were given high-fat diet to establish high blood lipid model.Then relevant drugs were intragastrically given 2 weeks later.Normal control group and model group were intragastrically given equal volume of distilled water，once a day，for 4 weeks.After last administration，blood lipid indexes（TG，TC，HDL-C，LDL-C，F(xiàn)FA），mRNA and protein expressions of lipid metabolism related genes（PPAR-α，CYP7A1，ACOX，SREBP-1c，ACC1）were detected.RESULTS：Compared w ith normal control group，serum contents of TC，TG，LDL-C，F(xiàn)FA in model group increased，HDL-C content decreased；PPAR-α，CYP7A1，ACOX mRNA and protein expressions were weakened，SREBP-1c，ACC1 mRNA and protein expressions were enhanced（P＜0.05）.Compared w ith model group，above-mentioned indexes were obviously improved in Xuezhiping capsule high-dose group，atorvastatin group and combination group（except for HDL-C in Xuezhiping capsule high-dose group）（P＜0.05）；TC，TG，F(xiàn)FA contents，and PPAR-α，CYP7A1，ACOX，ACC1 mRNA，and CYP7A1，SREBP-1c，ACC1 protein were obviously improved in Xuezhiping capsulemedium-dose group（P＜0.05）；TC，TG contents，and PPAR-αmRNA，and CYP7A1，SREBP-1c protein were obviously improved in Xuezhiping capsule low-dose group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Xuezhiping capsule has a prom ising effect of lowering blood lipid，the mechanism may be related to activating PPAR-αand inhibiting SREBP-lc signaling pathway.

Xuezhiping capsule；High blood lipid；Lowering blood lipid；Mechanism；Golden Hamster

R965

A

1001-0408（2017）16-2212-04

2016-09-20

2016-11-13）

＊碩士研究生。研究方向：心血管藥理。電話：010-51873226。E-mail：qshen666@126.com

#通信作者：研究員，博士生導師。研究方向：心血管藥理。電話：010-51873013。E-mail：sunguibo@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.14