新疆一枝蒿有效部位主要成分的制備與鑒定Δ

戎曉娟，顧政一，賀金華#，楊 璐（.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥物分析室，烏魯木齊 830004；.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑物化教研室，烏魯木齊 8300）

新疆一枝蒿有效部位主要成分的制備與鑒定Δ

戎曉娟1＊，顧政一1，賀金華1#，楊 璐2（1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥物分析室，烏魯木齊 830004；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑物化教研室，烏魯木齊 830011）

目的：建立新疆一枝蒿有效部位主要成分的快速識(shí)別和高效制備的方法，為民族藥的研究提供參考。方法：采用液相-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS/MS）法對(duì)一枝蒿有效部位的主要成分進(jìn)行初步推測(cè)，利用高效液相色譜、紫外光譜和質(zhì)譜法將部分化合物與相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)分析確定其名稱；對(duì)尚未確定的化合物采用柱分離及制備液相色譜技術(shù)快速獲得單體，并確定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果：從一枝蒿有效部位分離出5個(gè)化合物，鑒定出其中2個(gè)化合物為艾黃素和紫花牡荊素；獲得1個(gè)單體化合物（得率為0.35mg/g，純度為98.5%），經(jīng)結(jié)構(gòu)確證為6-去甲氧基-4′-O-甲基茵陳色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。結(jié)論：本試驗(yàn)建立的方法實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)成分的快速分離、鑒定、制備，可應(yīng)用于民族藥復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

一枝蒿；液質(zhì)聯(lián)用；制備液相色譜；分離；鑒定；單體制備；結(jié)構(gòu)確證

中藥、民族藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是闡明其藥效物質(zhì)、藥理作用及其機(jī)制和臨床療效的先決條件，也是深層次改進(jìn)工藝和劑型、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、提高臨床療效的重要基礎(chǔ)，是中藥現(xiàn)代化的重要組成部分。長(zhǎng)期以來，對(duì)中藥、民族藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究已經(jīng)取得了很大成就，但同時(shí)此項(xiàng)工作難度大、用時(shí)長(zhǎng)、耗試劑，大部分時(shí)間都在分離已知化合物，做了很多重復(fù)性工作，造成大量時(shí)間和資金的浪費(fèi)[1-2]。因此，能否快速識(shí)別已知成分，有目標(biāo)地分離未知成分或目標(biāo)化合物，從而提高工作效率，是中藥、民族藥研究亟待解決的問題。

一枝蒿（Artemisia rupestris L.）為菊科蒿屬（Artemisia L.）植物巖蒿的地上部分或全草，為新疆道地藥材，也是維吾爾醫(yī)常用傳統(tǒng)藥材，在我國(guó)主要分布在新疆北疆一帶[3]。一枝蒿具有清熱解毒、健胃消食、鎮(zhèn)靜止吐、抗過敏等功效[4]。本課題組前期對(duì)新疆一枝蒿黃酮類提取物進(jìn)行了抗乙肝病毒試驗(yàn)研究并確定了其有效部位[5-6]，在本試驗(yàn)中，則對(duì)該有效部位的主要成分進(jìn)行研究，以明確其成分組成并獲得一定量的單體，為后續(xù)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和柱色譜、制備液相色譜技術(shù)結(jié)合起來研究中藥、民族藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，是本課題組經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)和探索后總結(jié)的研究思路，即首先利用具有高效分離分析能力的液相-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS/MS）法對(duì)一枝蒿有效部位的成分進(jìn)行初步分析，推測(cè)可能化合物；并利用高效液相色譜（HPLC）、紫外光譜（UV）和質(zhì)譜法（MS）與已有的對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，確定部分化合物的結(jié)構(gòu)；繼而將傳統(tǒng)柱分離技術(shù)與具有高分離能力的制備液相色譜結(jié)合，快速、高效地獲得一定量純度較高的單體化合物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

1 材料

1.1 儀器

BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Dionex UltiMate 3000 HPLC系統(tǒng)、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀（Q-Exactivemass spectrometer）配備Xcalibur 2.3軟件（美國(guó)Thermo公司）；2545二元梯度系統(tǒng)制備型液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；INOVA-500核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian公司）；SK3300H超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

一枝蒿（新疆西部加斯特藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130823，由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所民族藥室何江副研究員鑒定為真品）；艾黃素對(duì)照品（批號(hào)：111879-201001，純度：98.3%）、紫花牡荊素對(duì)照品（批號(hào)：111871-201102，純度：99.1%）來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 一枝蒿黃酮類抗乙肝病毒有效部位的制備

將一枝蒿藥材粉碎，加入10倍量50%乙醇，加熱回流提取3次，提取時(shí)間分別為2、2、1 h，合并提取液，濾過，減壓濃縮，真空干燥，得浸膏。將浸膏粉末用水混懸，上樣于聚酰胺柱，依次用水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇進(jìn)行洗脫，收集各洗脫液，將50%乙醇洗脫液減壓濃縮、干燥，得50%乙醇洗脫物，即為有效部位[5]。

2.2 采用LC-HRMS/MS法對(duì)有效部位進(jìn)行成分分析

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取有效部位粉末適量，加入50%甲醇水適量，超聲30m in（功率：160W、頻率：59 kHz）至完全溶解，冷卻至室溫，定容，制成約2mg/m L的溶液，過微孔濾膜（0.2μm），取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～40 m in，20%B→85%B；40～45 m in，85%B；45～55 m in，20%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：200～400 nm；流速：1.0m L/m in；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30。柱后按1∶2分流，其中1/3進(jìn)入MS儀，2/3進(jìn)入廢液瓶。

2.2.3 MS條件 采用正、負(fù)離子全掃描模式，掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～1 500。電噴霧離子源霧化溫度為300，毛細(xì)管電壓為3 500～3 300V，離子傳輸管溫度為220，鞘氣壓力為40 arb，輔助氣壓力為11 arb，分辨率（R）為35 000。

2.2.4 LC-HRMS/MS法分析結(jié)果推測(cè) 對(duì)有效部位進(jìn)行分析后，出現(xiàn)5個(gè)化合物峰，結(jié)果見圖1、圖2；根據(jù)文獻(xiàn)[7-11]報(bào)道的一枝蒿化學(xué)成分推測(cè)出5個(gè)化合物的可能名稱，結(jié)果見表1。

2.3 2號(hào)、4號(hào)化合物與對(duì)照品比對(duì)

圖1 供試品HPLC圖Fig 1 HPLC chromatogramsof testsam ples

圖2 供試品總離子流色譜圖（正離子檢測(cè)模式）Fig 2 Total ion flow chromatogram s of test sam p les（positive ion detectionmode）

表1 5個(gè)化合物推測(cè)結(jié)果Tab 1 Speculative resultof5 compounds

根據(jù)上述推測(cè)結(jié)果，對(duì)各化合物進(jìn)行進(jìn)一步的比對(duì)和確認(rèn)。由于目前只有紫花牡荊素和艾黃素有市售對(duì)照品，故首先對(duì)2號(hào)和4號(hào)化合物進(jìn)行分析。

2.3.1 2號(hào)化合物與紫花牡荊素對(duì)照品比對(duì) （1）溶液的制備。精密稱取紫花牡荊素對(duì)照品約5mg，置于10 m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/m L的溶液，即得紫花牡荊素對(duì)照品。供試品溶液制備同“2.2.1”項(xiàng)下。（2）色譜條件。色譜柱：Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～40 m in，10%B→90%B；40～45 min，90%B；45～55m in，10%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：1.0m L/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30。（3）HPLC和UV圖譜比對(duì)。在上述“（2）”項(xiàng)色譜條件下，取紫花牡荊素對(duì)照品與供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果2號(hào)峰與紫花牡荊素對(duì)照品保留時(shí)間（分別為25.263、25.265m in）及UV吸收曲線一致，證實(shí)2號(hào)化合物即為紫花牡荊素。圖譜詳見圖3、圖4。

2.3.2 4號(hào)化合物與艾黃素對(duì)照品比對(duì) （1）溶液的制備。精密稱取艾黃素對(duì)照品約3mg，置于10m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.3mg/m L的溶液，即得艾黃素對(duì)照品溶液。供試品溶液制備同“2.2.1”項(xiàng)下。（2）色譜條件。同“2.3.1（2）”項(xiàng)下。（3）HPLC和UV圖譜比對(duì)。在“2.3.1（2）”項(xiàng)色譜條件下，取艾黃素對(duì)照品與供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果4號(hào)峰與艾黃素對(duì)照品保留時(shí)間（分別為28.633、28.638min）及UV吸收曲線一致，證實(shí)4號(hào)化合物即為艾黃素。圖譜詳見圖5、圖6。

圖3 2號(hào)化合物與紫花牡荊素對(duì)照品HPLC比對(duì)圖Fig 3 HPLC chromatogram com parison of com pound 2 and casticin reference substance

圖4 2號(hào)化合物與紫花牡荊素對(duì)照品UV比對(duì)圖Fig 4 UV chrom atogram com parison of com pound 2 and casticin reference substance

圖5 4號(hào)化合物與艾黃素對(duì)照品HPLC比對(duì)圖Fig 5 HPLC chromatogram com parison of com pound 4 and artem etin reference substance

圖6 4號(hào)化合物與艾黃素對(duì)照品UV比對(duì)圖Fig 6 UV chromatogram comparison of com pound 4 and artemetin reference substance

2.4 單體制備及鑒定

上文利用HPLC、UV、MS法將可能化合物與相應(yīng)對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)分析，確定了2號(hào)和4號(hào)化合物；但1號(hào)、3號(hào)和5號(hào)化合物名稱仍然未知，需要通過柱分離及制備液相色譜獲得單體，并確定結(jié)構(gòu)。

2.4.1 柱分離得粗分物 將有效部位制成粉末，用水混懸，依次用石油醚和三氯甲烷等體積萃取，將三氯甲烷萃取液合并，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得浸膏備用；取一枝蒿浸膏與硅膠以1∶1.5質(zhì)量比進(jìn)行吸附并揮干，濕法上樣于硅膠柱（徑高比為1∶8），依次用10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10比例的石油醚-乙酸乙酯洗脫，洗脫流速為1倍柱體積（BV）/h。分段收集，薄層色譜法監(jiān)測(cè)成分情況，在7∶3部分的洗脫液中有明顯清晰斑點(diǎn)，故將此部分收集、濃縮，經(jīng)重結(jié)晶純化后獲得粗分物。經(jīng)HPLC分析，粗分物的保留時(shí)間與供試品中的1號(hào)峰保留時(shí)間一致，故確定為1號(hào)化合物，色譜純度為88.0%，達(dá)不到采用核磁進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的純度要求，需用制備液相色譜進(jìn)一步純化。

2.4.2 制備液相色譜分離純化得單體化合物 為獲得高純度的單體，將1號(hào)粗分物進(jìn)一步采用高壓制備液相技術(shù)進(jìn)行分離純化。（1）樣品的制備。稱取1號(hào)粗分物粉末于量瓶中，加入70%甲醇，超聲20min（功率：160W，頻率：59 kHz）使溶解，制成約1mg/m L的溶液，過濾，即得。（2）制備液相色譜條件。制備型色譜柱：Xbridge Prep C1（8250mm×19mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～11m in，78%A；11～12m in，95%A；12～14min，78%A）；流速：9m L/min；進(jìn)樣量：2.0m L；檢測(cè)波長(zhǎng)：347 nm。（3）HPLC分析條件。色譜柱：Phenomenex Luna C1（8250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～40 min，10%A→90%A；40～45min，90%A；45～47min，10% A）；流速：1m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)：347 nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30。結(jié)果，經(jīng)上述制備條件，將1號(hào)粗分物制備多份，反復(fù)進(jìn)樣，收集樣品；獲得的樣品經(jīng)上述分析條件測(cè)定，色譜純度為98.5%，按一枝蒿藥材計(jì)得率為0.35 mg/g。

2.4.3 1號(hào)化合物結(jié)構(gòu)確認(rèn) 經(jīng)MS和核磁共振波譜進(jìn)行分析，解析1號(hào)化合物的結(jié)構(gòu)。

1號(hào)化合物：黃色無定形粉末，電子電離質(zhì)譜（EIMS）m/z：462，與分子式C22H22O11相符。氫譜（1H-NMR）[二甲基亞砜（DMSO），400 MHz]化學(xué)位移（δ）：5.10（1H，s，H-3），6.46（1H，d，J＝2，H-6），6.72（1H，s，H-8），7.36（1H，d，J＝4，H-2′），7.09（1H，d，J＝4，H-3′），7.09（1H，d，J＝4，H-5）′，7.36（1H，d，J＝4，H-6′），3.80（3H，s，—OCH3），12.81（1H，s，—OH）。13C-NMR（DMSO，125 MHz）δ：168.32（C-2），87.60（C-3），183.37（C-4），161.22（C-5），100.24（C-6），162.89（C-7），94.95（C-8），154.70（C-9），103.85（C-10），144.46（C-1）′，122.12（C-2）′，115.60（C-3）′，158.00（C-4）′，115.60（C-5）′，122.12（C-6）′，100.02（Glc-1），73.25（Glc-2），76.57（Glc-3），69.75（Glc-4），77.33（Glc-5），60.80（Glc-6），55.78（C-4′，—OCH3）。結(jié)合文獻(xiàn)[12]，確定該化合物為6-去甲氧基-4′-O-甲基茵陳色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖7。

3 討論

本試驗(yàn)研究所用的新疆一枝蒿黃酮類提取物經(jīng)藥效試驗(yàn)證實(shí)其具有較強(qiáng)的抗乙肝病毒活性[5]，故對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行深入研究意義較大。在分離目標(biāo)化合物時(shí)，首先選擇傳統(tǒng)的柱色譜進(jìn)行粗分，再選擇制備液相色譜進(jìn)行純化，將前者分離上樣量大與后者分離能力強(qiáng)相結(jié)合，能快速、高效地獲得純度較高的單體，更適合研究復(fù)雜的中藥、民族藥的物質(zhì)組成。

圖7 6-去甲氧基-4′-O-甲基茵陳色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷結(jié)構(gòu)式Fig 7 Chem ical structural form ula of 6-demethoxy-4′-O-m ethoxy-capillarisin-7-O-β-D-glucoside

另外，由于時(shí)間限制本試驗(yàn)尚未對(duì)3號(hào)和5號(hào)化合物進(jìn)行分離制備和結(jié)構(gòu)確認(rèn)，后續(xù)將借鑒本文方法和思路進(jìn)行該項(xiàng)工作。

綜上，本試驗(yàn)采用的研究思路目標(biāo)明確、高效快速，不僅可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的快速分離鑒定，而且可以實(shí)現(xiàn)活性組分的快速制備，獲得的較高純度的單體成分將為一枝蒿作用機(jī)制的研究提供物質(zhì)保障。

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Preparation and Identification of M ain Ingredients in Effective Parts of Xinjiang Artem isia rupestris

RONG Xiaojuan1，GU Zhengyi1，HE Jinhua1，YANG Lu2（1.Dept.of Pharmaceutical Analysis，the Xinjiang Institute of Material Medica，Urumqi 830004，China；2.Dept.of Pharmacology and Physiology，College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China）

Artemisia rupestris；LC-MS；Preparative liquid chromatography；Separation；Identification；Monomer preparation；Structure identification

R284.2

A

1001-0408（2017）16-2227-04

2016-09-20

2017-02-20）

（編輯：劉 萍）

國(guó)家自然科學(xué)基金新疆聯(lián)合基金資助項(xiàng)目（No. U1303224）

＊助理研究員，碩士。研究方向：藥物分析。電話：0991-2326572。E-mail：109303620@qq.com

#通信作者：研究員，碩士。研究方向：藥物分析。電話：0991-2326572。E-mail：hejh1216@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.18

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish amethod for rapid identification and efficient preparation ofmain ingredients in effective parts of Xinjiang Artemisia rupestris，and provide reference for researching the ethnic medicines.METHODS：LC-HRMS/MSwas conducted for the preliminary study ofmain ingredients in effective parts of A.rupestris.HPLC，UV and MSwere used to compare and analyze parts of the compounds and its reference substances，their names were determ ined.Column separation and preparative liquid chromatography were used for the undeterm ined compounds to receive monomer rapidly，and the structures were identified. RESULTS：5 compounds were separated from the effective parts，2 of which were identified as artemetin and casticin.A monomeric compound was obtained（yield was 0.35mg/g，the purity was 98.5%），which was confirmed to be 6-demethoxy-4′-O-methoxycapillarisin-7-O-β-D-glucoside by the structure.CONCLUSIONS：The method has achieved rapid separation，identification and preparation of target ingredients，which can be used for the fundamental research of ethnicmedicine complex materials.