建澤瀉鹽炙工藝優化及其HPLC指紋圖譜的建立Δ

陳 瑩，丘建芳，黃小強，許 文，2，李小艷，吳水生#（.福建中醫藥大學藥學院，福州 35022；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福州 35022）

建澤瀉鹽炙工藝優化及其HPLC指紋圖譜的建立Δ

陳 瑩1＊，丘建芳1，黃小強1，許 文1，2，李小艷1，吳水生1#（1.福建中醫藥大學藥學院，福州 350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福州 350122）

目的：優化建澤瀉鹽炙工藝并建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：以23-乙酰澤瀉醇B、總三萜含量和外觀性狀綜合評分為指標，采用單因素試驗和正交試驗，優化建澤瀉鹽炙工藝中用鹽量、炒制溫度和炒制時間3個因素的水平。采用HPLC法分別在208、245 nm波長下建立10批建澤瀉鹽炙品的指紋圖譜，經軟件比較其與對照圖譜的相似度。結果：最優工藝為每100 kg澤瀉加10 kg水溶解的2 kg鹽，悶潤1 h，在100 ℃下炒制8min。驗證試驗中，3批鹽炙品外觀性狀均符合要求，綜合評分平均值為93.94（RSD＝6.63%，n＝3）；23-乙酰澤瀉醇B和總三萜含量穩定，RSD分別為7.41%、7.39%（n＝3）。在208、245 nm波長下分別標定了建澤瀉鹽炙品的17、10個共有峰；10批樣品指紋圖譜相似度均大于0.9。結論：優化的建澤瀉鹽炙工藝合理可行、重現性好；建立的指紋圖譜共有峰穩定，可用于建澤瀉鹽炙品的質量評價。

建澤瀉；鹽炙工藝；正交試驗；高效液相色譜；指紋圖譜；23-乙酰澤瀉醇B；三萜類化合物

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉[Alisma orientale（Sam.）Juzep.]的干燥塊莖，別名水瀉、水澤等，味甘、性寒，歸腎、膀胱經，是具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂作用的傳統中藥材[1]。澤瀉在福建地區具有悠久的栽培歷史[2]，宋代《本草圖經》和明代《本草乘雅半偈》均記載福建產澤瀉、清代《本草精匯品要》記載閩產澤瀉為道地藥材，稱“建澤瀉”。從古至今澤瀉有多種炮制方法，如《雷公炮炙論》首載的酒浸法[3]及后炙、鹽水伴、鹽水炒焦、麩炒、土炒等炮制方法[4]。其中鹽澤瀉能引藥下行，具有增強滋陰、利水的作用，為目前臨床使用的主要澤瀉炮制飲片[5]。現代化學和藥理研究表明，澤瀉利尿、降血脂的主要有效成分為原萜烷型四環三萜[6]。目前對澤瀉炮制工藝的研究以鹽炙為主，已有以23-乙酰澤瀉醇B為指標對澤瀉鹽炙工藝進行優化的文獻報道[7]，但是已有研究表明不同炮制溫度和時間下澤瀉三萜成分易發生相互轉化[8]，故單一指標難以全面反映澤瀉鹽炙品的內在品質。同時建澤瀉作為道地藥材，以成品的外觀性狀作為炮制工藝的參考指標難以做到客觀、可控、穩定和可重復，且其鹽炙炮制工藝和鹽炙品指紋圖譜均少見文獻報道，故有必要開展建澤瀉規范化炮制工藝及其炮制品指紋圖譜的評價研究。

本試驗以2015年版《中國藥典》（一部）澤瀉項下指標23-乙酰澤瀉醇B及建澤瀉4種主要三萜（23-乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇C，以下稱總三萜）的總和、外觀性狀為綜合指標，采用單因素試驗和多指標正交試驗法，考察炮制用鹽量、溫度和時間3個因素的最優水平，優化建澤瀉鹽炙工藝，并在此基礎上建立建澤瀉鹽炙飲片高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，分別對208 nm和245 nm波長下的共有峰進行標定和指認，從多指標和整體成分群定性的角度綜合評價建澤瀉鹽炙品，為其炮制和質量評價提供試驗依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT HPLC儀（日本島津公司）；FY135中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DV215CD十萬分之一分析天平（美國奧豪斯公司）；KQ-500E臺式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CCFG-160B電炒鍋（福建省邵武市永樂無線電廠）；M illi-Q超純水機（美國默克密理博公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

10批生澤瀉飲片（購于福建省金山醫藥實業集團有限公司，來自福建建甌澤瀉藥材生產質量管理規范基地，批號分別為：130110、130115、130121、130127、130211、130219、130227、130309、130316、130325，編號為S1～S10）經福建中醫藥大學范世明高級實驗師鑒定為澤瀉科植物澤瀉[Alisma orientale（Sam.）Juzep.]的干燥塊莖，樣本存放于福建中醫藥大學藥學院藥用植物標本室；23-乙酰澤瀉醇B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111846-201102，純度：≥98.5%）；澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇C對照品（批號分別為：YAO02、YAO03、YAO08，純度：＞98.5%）和澤瀉醇F、11-去氧澤瀉醇B、16-羰基澤瀉醇A、16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉烯醇對照品（批號分別為：YAO046、YAO07、YAO11、YAO12、YAO13、YAO04）均由福建中醫藥大學藥學院制備，供指紋圖譜定性對比使用；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純，鹽為食用級。

2 方法與結果

2.1 4種三萜類化合物含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C1（8150mm× 4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（73∶27）；流速：1.0 m L/m in；檢測波長：208、245 nm；柱溫：30；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取23-乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇C對照品適量，精密稱定，加入乙腈溶解并定容，分別制備成質量濃度為151.7、152.5、196.0、156.5μg/m L的單一對照品貯備液。試驗所用其他質量濃度的對照品溶液分別由乙腈稀釋貯備液得到。

2.1.3 供試品溶液的制備 取過40目篩的澤瀉樣品粉末（批號：130110）約0.5 g，精密稱定并置于具塞錐形瓶中，精密加入乙腈25m L，密塞，稱定質量，超聲（功率：250W，頻率：50 kHz）提取30m in，放冷，再稱質量，用乙腈補足減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液備用，即得。

2.1.4 專屬性考察 取上述對照品和供試品溶液進樣測定，2個波長下色譜峰分離良好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.5 線性關系考察 分別取“2.1.2”項下方法制備的各對照品貯備液，用乙腈稀釋，制備成7個系列質量濃度的各對照品溶液。精密吸取10μL，進樣測定，以峰面積（y）對分析物質量濃度（x）作線性回歸，結果見表1。

表1 4種三萜類成分線性關系考察結果Tab 1 Results of linear relationship of 4 kinds of triterpenoids

2.1.6 精密度、重復性、穩定性、加樣回收率試驗 按相關方法進行考察。結果，精密度試驗中4種成分峰面積的RSD均未超過1.47%（n＝6），表明精密度良好；重復性試驗中4種成分含量的RSD均未超過1.63%（n＝6），表明方法重復性良好；穩定性試驗中4種成分峰面積的RSD均未超過1.56%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定；加樣回收率試驗中4種成分的平均回收率分別為100.18%、96.59%、97.56%、97.79%（RSD均未超過2.70%，n＝6），表明方法準確度良好。

2.1.7 含量測定方法 分別取對照品溶液和供試品溶液，進樣測定峰面積，采用外標法計算含量。

2.2 單因素試驗考察鹽炙工藝

2.2.1 綜合評分標準 以23-乙酰澤瀉醇B、總三萜含量為內在指標，外觀性狀為外在指標，應用綜合加權評分法處理數據。中藥飲片的外觀性狀評分參照《中國藥典》對鹽澤瀉性狀的要求[1]，即外觀性狀總分為飲片表面色澤、質地與氣味評分之和，具體評分標準見表2。

表2 外觀性狀評分標準Tab2Appearanceandcharacterscoringcriterion

[9]，確定各指標權重為23-乙酰澤瀉醇B含量50%、總三萜含量35%、外觀性狀15%。評分方法：各項評分均為y＝xi/xmax×權重系數×100（xmax為各項指標中含量或外觀性狀評分最高值，xi為對應各項指標或外觀性狀評分值），總分為各項指標評分的總和。

2.2.2 用鹽量的考察在預試驗的基礎上，分別稱取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g鹽，分別加入4g水溶解，悶潤澤瀉，使鹽水滲入澤瀉飲片內部，飲片潤濕程度基本相同。取澤瀉5份，每份40g，悶潤1h后，100下炒制12 min，考察用鹽量。將上述澤瀉鹽炙品粉碎后過40目篩，評價各指標。結果，用鹽量為0.8g時，綜合評分最高，隨后逐漸下降，詳見表3。

表3 單因素試驗考察結果Tab3Resultsofsinglefactortest

2.2.3 炒制溫度的考察2015年版《中國藥典》（四部）0213炮制通則規定鹽炙法以文火加熱，將待炮炙品炒至規定程度。已有報道指出文火溫度為80～120[10]，而溫度過高澤瀉易出現焦斑，故選擇80～160考察炒制溫度。取澤瀉5份，各40g，分別用4g水溶解0.8g鹽量制備的鹽溶液悶潤1h后，經不同溫度（80、100、120、140、160）炒制12min后取出，放涼。將上述澤瀉鹽炙品粉碎后過40目篩，評價各指標。結果，隨著炒制溫度的升高，綜合評分值先上升后下降，100時最高，詳見表3。

2.2.4 炒制時間的考察取澤瀉5份，各40g，分別用4 g水溶解0.8g鹽量制備的鹽溶液悶潤1h，炒制溫度為100，分別炒制不同時間（4、8、12、16、20min），取出放涼。將上述澤瀉鹽炙品粉碎后過40目篩，評價各指標。結果，炒制時間為12min時綜合評分值最高，詳見表3。但考慮到4min炮制時間過短，飲片外觀性狀不佳，結合此結果，選擇將正交試驗設計中時間的3個水平分別設為8、10、12min。

2.3 正交試驗優化鹽炙工藝

根據單因素試驗考察結果，確定A（用鹽量，g）、B（炒制溫度，）、C（炒制時間，min）3因素為正交試驗考察因素，每個因素擬定3個水平，以綜合評分為指標，采用L（934）正交表設計試驗。因素與水平見表4，正交試驗設計與結果見表5，方差分析結果見表6。

表4 因素與水平Tab4Factorsandlevels

表5 正交試驗設計與結果Tab5Designandresultsoforthogonaltest

表6 方差分析結果Tab6Resultsofvarianceanalysis

表5結果表明，對綜合評分影響大小依次為B（炒制溫度）＞A（用鹽量）＞C（炒制時間）。方差分析結果表明，因素B對試驗結果有顯著影響，而A和C無顯著影響。選取最優鹽炙工藝為A2B2C1，即每40g澤瀉加4g水溶解的0.8g鹽（每100kg澤瀉加10kg水溶解的2kg鹽），悶潤1h，在100下炒制8min。

2.4 中試驗證試驗

取3份大小均勻的干燥生澤瀉飲片，每份40kg，在中試設備上按上述優化的鹽炙工藝條件制備3批鹽澤瀉飲片，驗證工藝的可靠性。結果制備的3批鹽澤瀉外觀性狀均符合《中國藥典》標準，各指標綜合評分均大于87，批間RSD小于7.41%（n＝3）。另外，對每批鹽澤瀉的指標均平行測定3次，結果，批次內的澤瀉指標含量相對接近，批內RSD小于3%（n＝3）；且外觀性狀評分穩定，RSD小于4%（n＝3），均符合《中國藥典》要求。這表明優化的工藝穩定可行，得到的成品質量穩定。驗證試驗結果見表7。

表7 驗證試驗結果（n＝3）Tab 7 Resu ltsof verification test（n＝3）

2.5 建澤瀉鹽炙品指紋圖譜研究

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C1（8150 mm× 4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5min，35%A；5～20min，35%A～55%A；20～35m in，55%A～65%A；35～45m in，65%A～75%A；45～55m in，75%A～85%A；55～65m in，85%A）；流速：1m L/min；檢測波長：208、245 nm；柱溫：30；進樣量：10μL。

2.5.2 供試品溶液的制備 按優化的建澤瀉鹽炙工藝制備10批鹽澤瀉飲片，精密稱取過40目篩鹽炙品粉末2.0 g，置于50m L具塞錐形瓶中，其余操作同“2.1.3”項。

2.5.3 混合對照品溶液的制備 取23-乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇C、澤瀉醇F、11-去氧澤瀉醇B、16-羰基澤瀉醇A、16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉烯醇對照品適量，精密稱定，分別加入乙腈溶解并稀釋制備成約1.0μg/m L對照品溶液并混合，供定性分析使用。

2.5.4 方法學考察 （1）系統適用性及專屬性試驗。精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10μL，按“2.5.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結果在2個檢測波長下各化合物與其相鄰峰的分離度均大于1.5，拖尾因子為0.95～1.05，理論板數以各色譜峰計均大于10 000，表明該條件下方法專屬性良好。（2）精密度、穩定性、重復性試驗。取批號為130110的澤瀉鹽炙品供試品溶液，按相關方法進行考察。結果，精密度試驗中各共有峰相對保留時間的RSD為0.16%～0.34%（n＝6），相對峰面積的RSD為0.45%～3.87%（n＝6），表明儀器精密度良好；穩定性試驗中各共有峰相對保留時間的RSD為0.12%～0.27%（n＝6），相對峰面積的RSD為1.13%～4.99%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好；重復性試驗中各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.12%（n＝6），相對峰面積的RSD為2.81%～4.96%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.5.5 澤瀉鹽炙品指紋圖譜建立 （1）參照峰的選擇。取“2.5.2”項制備的10批澤瀉鹽炙品供試品溶液各10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件測定，得到10批澤瀉鹽炙品的HPLC圖譜。選擇指紋圖譜中保留時間適中且峰面積較穩定的色譜峰為參照峰。結果表明，在208 nm波長下13號峰（23-乙酰澤瀉醇B）和245 nm波長下6號峰（23-乙酰澤瀉醇C）與相鄰色譜峰分離良好、基線穩定，并且在澤瀉中含量較高，故分別確定為208 nm和245 nm波長下的參照峰。（2）共有峰的標定及指認。將10批（S1～S10）澤瀉鹽炙品HPLC圖譜導入中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件（2004A版）中進行色譜峰匹配，經多點校正后進行峰自動匹配，計算并生成對照圖譜R。圖譜在208 nm波長下共標定17個共有峰，經對照品定性，指認6個峰，其中5、6、8、10、13、15號峰分別為澤瀉醇F、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉烯醇、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、11-去氧澤瀉醇B；245 nm波長下共標定10個共有峰，指認5個峰，其中1、2、3、4、6號峰分別為16-羰基澤瀉醇A、16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇C。2個波長下共有峰峰面積總和均占各自波長下所有檢出色譜峰峰面積總和的95%以上。（3）相似度評價。應用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件（2004A版），將10批澤瀉鹽炙品的HPLC圖譜導入并計算相似度。結果，10批澤瀉鹽炙品相似度在208 nm波長下分別為0.999、0.999、0.999、0.997、0.998、0.998、0.994、0.998、0.998、0.999，在245 nm波長下分別為0.993、0.999、0.994、0.998、0.985、0.996、0.996、0.997、0.991、0.946，均大于0.9，表明各批藥材質量穩定，批次間差異較小。生成的對照圖譜和雙波長HPLC指紋圖譜見圖2。

3 討論

建澤瀉是閩產道地藥材之一，為臨床常用大宗中藥，文獻記載有酒制、鹽制、清蒸、麩制、土制等諸多炮制方法，“健脾生用或酒炒用，滋陰利水鹽水炒”[11]。澤瀉甘寒，入腎、膀胱經；鹽味咸，引藥入腎與膀胱，能夠增強澤瀉的利水滲濕、泄熱通淋之功。因而開展澤瀉的鹽制炮制機制研究、制定鹽制工藝標準有積極的現實意義。

3.1 工藝優化指標的選擇

首先，澤瀉化學成分主要為三萜類成分[12]，是其利尿[13]、降脂[14]、降糖[15]等作用的有效物質基礎。《中國藥典》將23-乙醇澤瀉醇B作為指標性成分[1]，因此，本試驗將其作為炮制工藝優化的指標之一。其次，澤瀉三萜化合物性質不穩定，具體表現在產地加工、炮制等過程中會發生化學成分的轉化，因此選擇4種三萜化合物的總含量[16]作為總三萜評價指標。此外，由于外觀性狀評價與炮制程度有相關性[4]，筆者同時參考文獻[6]，設置了色澤、質地、粉性、焦斑情況及味咸情況等外觀性狀指標。

3.2 2個試驗中色譜條件及方法學考察項目的區別

圖2 高效液相指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint

在4種成分的含量測定和建澤瀉鹽炙品指紋圖譜的建立中，流動相分別采用了等度洗脫和梯度洗脫。等度洗脫可將4個化合物進行分離和洗脫，但在建立指紋圖譜時，由于澤瀉中成分復雜，等度洗脫不能達到較多成分基線分離的效果，而梯度洗脫則可，并可得到更多分離度良好的色譜峰，故后者采用梯度洗脫。另外，在指紋圖譜的建立中，方法學考察的項目主要是根據國家食品藥品監督管理總局印發的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》和文獻[17]設立的，而含量測定的方法學考察項目則是根據2015年版《中國藥典》方法學驗證指導原則設立的，故二者考察項目不同。

3.3 建澤瀉鹽炙品的指紋圖譜研究

本試驗在優化建澤瀉鹽炙工藝的基礎上，首次研究并建立了福建道地藥材澤瀉鹽炙品的雙波長（208 nm和245 nm）指紋圖譜，各共有峰穩定性較好，相似度分別在0.994和0.946以上，符合指紋圖譜建立的要求，故該方法可以對建澤瀉鹽炙品進行有效的質量評價。

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Technology Optim ization of Stir-bake w ith Saltwater Processing for Fujian A lismatis Rhizoma and Establishm ent of Its HPLC Fingerprint

CHEN Ying1，QIU Jianfang1，HUANG Xiaoqiang1，XU Wen1，2，LIXiaoyan1，WU Shuisheng1（1.School of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China；2.Biomedical Research and Development Center，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China）

OBJECTIVE：To optim ize the stir-bake w ith saltwater processing technology for Fujian A lismatis rhizoma，and establish its HPLC fingerprint.METHODS：Using 23-acetyl alisol B，total triterpenoids contents and appearance as comprehensive indexes，single factor experiment and orthogonal testwere employed，3 factors’levels including the quantity of salt，processing temperature and time were optimized.HPLC was used to develop fingerprints of 10 batches of Fujian Alismatis rhizoma atwavelength of 208，245 nm；the sim ilarity between fingerprints and control profile was compared by using software.RESULTS：The optimal technology was as follow as 2 kg salt dissolved w ith 10 kg water for each 100 kg Fujian A lismatis rhizoma，moistening for 1 h，stir-frying for 8 minutes under 100 ℃.In verification test，the appearance of 3 batches of processed products were all in line w ith requirements，average comprehensive score was 93.94（RSD＝6.63%，n＝3）；23-acetyl alisol B and total triterpenoids contents were stable（RSD＝7.41%，7.39%，n＝3），respectively.Totally 17 and 10 common peaksweremarked in 208 nm and 245 nm respectively；sim ilarities of 10 batches of samples’fingerprintswere higher than 0.9.CONCLUSIONS：Optim ized stir-bake w ith saltwater technology is reasonable，feasible，and reproducible；the stability of common peaks of established fingerprints can conduct effective quality evaluation for Fujian Alismatis rhizoma processed by saltwater.

Fujian A lismatis rhizoma；Stir-bake w ith saltwater technology；Orthogonal test；HPLC；Fingerprint；23-acetyl alisol B；Triterpenoids

R283

A

1001-0408（2017）16-2244-05

2016-09-01

2016-10-17）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學基金資助項目（No.U1205022）；國家科技支撐計劃課題（No.2011BAI01B06）；國家中醫藥管理局國家中藥標準化項目（No.ZYB2H-Y-FJ-09）；福建省教育廳中青年教師教育科研項目（No.JA15242）

＊碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質基礎及作用機制。電話：0591-22861135。E-mail：chenying578119815@163.com

#通信作者：教授。研究方向：中藥復方藥效物質及其作用機制。電話：0591-22861135。E-mail：wushuishengwss@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.23