脂蟾毒配基PLGA-TPGS納米粒的體外細胞攝取及毒性研究Δ

徐 紅，高 萌，褚秋辰，董 浩，陳 雨，徐榮謙，張成鴻，田 燕#（.大連醫科大學基礎醫學院，遼寧大連 6044；.大連醫科大學藥學院，遼寧大連 6044；.大連醫科大學八年制06級臨床醫學專業，遼寧大連 6044）

脂蟾毒配基PLGA-TPGS納米粒的體外細胞攝取及毒性研究Δ

徐 紅1＊，高 萌2，褚秋辰2，董 浩2，陳 雨3，徐榮謙3，張成鴻1，田 燕2#（1.大連醫科大學基礎醫學院，遼寧大連 116044；2.大連醫科大學藥學院，遼寧大連 116044；3.大連醫科大學八年制2016級臨床醫學專業，遼寧大連 116044）

目的：研究脂蟾毒配基（RBG）乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E（PLGA-TPGS）納米粒（RPTN）體外被人肝癌HepG2細胞、小鼠腹水型高淋巴道轉移腫瘤HCa-F細胞的攝取情況和對HepG2細胞的毒性。方法：制備包載RBG和熒光標記物香豆素6的PLGA-TPGS納米粒（RCPTN），熒光倒置顯微鏡觀察HepG2、HCa-F細胞對RCPTN的體外攝取情況。將試驗分為陰性對照組、空白PLGA-TPGS納米粒（EPTN）組、5-氟尿嘧啶溶液（FS）組、RBG溶液（RS）組、RBG/PLGA納米粒（RPN）組、RPTN組，采用水溶性四氮唑（WST-1）法考察不同終質量濃度（1.25、2.5、5、10、20μg/m L）的FS、RS、RPN和RPTN作用24、48、72 h后HepG2細胞在450 nm波長下的光密度，計算細胞存活率（CV）和半數抑制濃度（IC50）。結果：RCPTN分布在HepG2、HCa-F細胞的細胞核周圍。RPN組和RPTN組細胞的CV隨RBG濃度增加而減小，隨作用時間延長而減小；與FS組比較，RPTN組細胞的CV均減小（P＜0.05或P＜0.01）。FS、RS、RPN和RPTN作用于HepG2細胞的IC50隨時間的延長而減小，且IC50的大小依次為RS＞FS＞RPN＞RPTN；RPN和RPTN作用48、72 h的IC50明顯小于FS與RS（P＜0.05或P＜0.01）。結論：RPTN可將RBG帶入HepG2、HCa-F細胞內部，其對HepG2細胞具有抑制作用，且作用強于RPN、RS和FS。

脂蟾毒配基；乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E；納米粒；肝癌HepG2細胞；腹水型高淋巴道轉移腫瘤HCa-F細胞；細胞攝取；體外細胞毒性

脂蟾毒配基（Resibufogenin，RBG）是中藥蟾酥的主要成分之一[1]，具有廣泛的生理、藥理活性，如強心、增強心肌收縮、升血壓、抗腫瘤等[2-5]。眾多的細胞試驗和動物試驗均證明RBG是一種發展前景良好的天然抗癌藥物[6-8]，能作用于腫瘤發生的不同階段，促使癌細胞凋亡。但因其本身難溶于水，并且具有較強的心臟毒性，口服生物利用度非常低，影響了其在臨床上的應用。

納米粒（Nanoparticles）是一種毒性相對較小、穩定性好的靶向制劑，iv后能將包載的藥物靶向運送到肝、脾、骨髓等，降低藥物在其他組織中的分布，從而提高療效、減輕毒副作用[9]。納米粒能否被腫瘤細胞直接攝取，對于納米粒給藥系統的研究與評價十分重要，較常用的方法是將納米粒載體材料進行熒光標記或將熒光標記物包載到納米粒內部后，在熒光顯微鏡下觀察納米粒被細胞攝取的過程。香豆素6（Coumarin-6，C6）是近年來常用于納米粒給藥系統體內示蹤、體外細胞攝取等研究的脂溶性熒光標記物[10-11]，具有性能穩定、熒光轉化率高等優點。

本研究用自制材料乳酸羥基乙酸共聚物-水溶性維生素E（PLGA-TPGS）為載體，制備同時包載模型藥物RBG和熒光標記物C6的RBG/C6-PLGA-TPGS納米粒（RCPTN），利用C6的綠色熒光直觀地研究人肝癌細胞HepG2和小鼠腹水型高淋巴道轉移腫瘤細胞HCa-F對RCPTN的攝取情況。同時以PLGA-TPGS為載體，制備只包載RBG的RBG/PLGA-TPGS納米粒（RPTN），并以市售材料PLGA為載體制備的RBG/PLGA納米粒（RPN）為對照[12]，采用水溶性四氮唑（WST-1）法考察RPTN和RPN對HepG2細胞的細胞毒性，以期為RPTN的體內靶向性評價、藥效學研究等奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；354型酶標儀（美國Thermo公司）；IX81倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Sorvall ST 16R臺式離心機（美國Thermo Fisher公司，離心半徑：13.5 cm）。

1.2 藥品與試劑

RBG原料藥（大連醫科大學藥物化學教研室提供，批號：20121120，純度：98%）；RCPTN[批號：20140110，規格：RBG 92 mg/g、C6 108 mg/g，粒徑：（154.6±3.6）nm]、RPTN[批號：20140109，規格：RBG 183mg/g，粒徑：（150.8±2.7）nm]、RPN[批號：20140109，規格：RBG 150 mg/g，粒徑：（342.1±2.9）nm]、空白PLGA-TPGS納米粒（EPTN，批號：20140110）均由大連醫科大學藥劑學教研室提供；5-氟尿嘧啶注射液（FS，上海旭東海普藥業有限公司，批號：1402181，規格：25mg/m L）；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、優級胎牛血清（美國羅氏應用科學公司，批號：M 1680、20120906）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，北京索萊寶科技有限公司，批號：20130110）；碘化丙啶（PI，美國Sigma公司，批號：SLBC3518V，純度：94.0%）。

1.3 細胞株與動物

人肝癌細胞HepG2購買于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；小鼠腹水型高淋巴道轉移腫瘤細胞HCa-F由大連醫科大學形態學教研室提供。健康昆明種小鼠，SPF級，8周齡，體質量20～25 g，♀♂不限，由大連醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（遼）2008-0002。

2 方法與結果

2.1 體外細胞攝取試驗

2.1.1 細胞培養 （1）HepG2細胞在含10%胎牛血清的H-DMEM培養基中，于37、飽和濕度、含5%CO2的培養箱中培養，待細胞生長至80%～90%融合時，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）洗滌，0.25%胰酶消化液分散成單細胞懸液，取對數生長期的細胞進行試驗。（2）常規方法復蘇凍存的HCa-F細胞，調細胞密度為3×107個/m L，取200μL的細胞懸液接種在小鼠腹腔，培養腹水。

2.1.2 HepG2細胞攝取試驗 參考文獻[13]進行操作，取對數生長期HepG2細胞加至24孔板，細胞密度為1× 105個/孔，培養24 h。用含200μg/m L C6的RCPTN（RBG為170.4μg/m L，下同）在37下孵育4 h，冷PBS洗3次，75%乙醇固定10m in，吸走乙醇，冷PBS再洗3次，每次5m in。將200 ng/m L的DAPI加至樣品孔中，染色15m in，冷PBS洗3次，每次5m in，用熒光倒置顯微鏡觀察。結果顯示，RCPTN分布在HepG2細胞核周圍，顯微鏡圖見圖1。

圖1 HepG2細胞攝取RCPTN的顯微鏡圖（×400）Fig 1 M icroscopy images of RCPTN by HepG2 cell up take（×400）

2.1.3 HCa-F細胞攝取試驗 取活小鼠腹水2～3m L，置于10m L滅菌離心管中，加入適量PBS，離心（1 000 r/min，5min，下同），棄上清，再加入PBS重復操作至細胞沉淀內無血色。向沉淀中加3m LRCPTN[13]，輕輕吹散，于37、5%CO2培養箱中孵育4 h，離心，沉淀用冷PBS洗3次，75%乙醇固定10m in后再離心，沉淀用冷PBS洗3次。每孔加PI（0.5μg/m L）300μL染色15min后離心，沉淀用冷PBS洗3次，取少量細胞懸液壓片，用倒置熒光顯微鏡觀察。結果顯示，RCPTN分布在HCa-F細胞核周圍，顯微鏡圖見圖2。

2.2 體外細胞毒性試驗

圖2 HCa-F細胞攝取RCPTN的顯微鏡圖（×400）Fig 2 M icroscopy images RCPTN by HCa-F cell uptake（×400）

2.2.1 分組與給藥 為了消除96孔板和加入的培養液在測定樣品時對光密度（OD）的影響，先用酶標儀測定450 nm波長下只加入50μL高糖DMEM培養液的空白96孔板的OD空白孔（n＝6）。試驗共分為6組，每個濃度6個復孔。（1）陰性對照組：接種細胞后不加任何藥物，加入50μL高糖DMEM培養液；（2）EPTN組：接種細胞后加入50μLEPTN混懸液；（3）FS組：接種細胞后加入50 μL FS（5-氟尿嘧啶終質量濃度分別為1.25、2.5、5、10、20 μg/m L）；（4）RBG溶液（RS）組：接種細胞后加入50μL RS（用含0.1%二甲基亞砜的無血清高糖DMEM培養液配制）；（5）RPN組：接種細胞后加入50μLRPN混懸液；（6）RPTN組：接種細胞后加入50μL RPTN混懸液。其中，RPTN、RPN、RS組中RBG終質量濃度均分別為1.25、2.5、5、10、20μg/m L。試驗中所有的納米粒在給藥前均需分散到適量無血清高糖DMEM培養液中，100W超聲處理60 s，形成納米粒的混懸液。

2.2.2 細胞存活率的測定 取對數生長期HepG2細胞，以1×104個/孔的細胞懸液接種于96孔板，每孔100μL。按“2.2.1”項下分組加入藥物，分別作用24、48、72 h后，每孔加入WST-1溶液10μL，繼續孵育4 h后終止培養。在酶標儀450 nm波長處測定各孔的OD，參比波長為600 nm，計算細胞存活率（CV）[CV（%）＝（OD加藥孔－OD空白孔）/（OD陰性對照孔－OD空白孔）×100%]。

2.2.3 數據處理與結果 用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。數據以±s表示，多組資料采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。各組細胞的CV測定結果見表1。

由表1可知，（1）HepG2細胞在EPTN組最大濃度下培養72 h的CV為（98.43±0.19）%，表明本研究制備納米粒所用的材料PLGA-TPGS對HepG2細胞無明顯的毒性；（2）隨RBG質量濃度的增加、孵育時間的延長，RPN、RPTN組細胞的CV均降低（P＜0.01），表明RPN和RPTN的體外抗腫瘤作用有RBG濃度依賴性和作用時間依賴性；（3）RS組細胞的CV與FS組比較均無明顯差別，說明RS和FS加入細胞后能迅速達到最大藥物釋放量，從而發揮抗腫瘤作用，故不同時間點HepG2細胞的CV變化較小；（4）當納米粒中RBG濃度為20μg/m L時，孵育時間為48 h、72 h時，RPN、RPTN組的CV較同濃度同孵育時間點FS組的CV均顯著降低（P＜0.01），表明RPN、RPTN具有很好的體外抗腫瘤活性和一定的緩釋作用。⑤與RPN組比較，RPTN組細胞的CV均減低，表明RPTN體外抗腫瘤細胞作用優于RPN。

表1 各組細胞的CV測定結果（±s，n＝6）Tab 1 Determ ination resultsof CV in each group（± s，n＝6）

表1 各組細胞的CV測定結果（±s，n＝6）Tab 1 Determ ination resultsof CV in each group（± s，n＝6）

注：與FS組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.FSgroup，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

作用時間，h 24 CV，% 48 72 RPTN組75.12±0.21＊72.31±0.24＊68.46±0.22＊61.32±0.15＊45.17±0.13＊58.23±0.11＊52.67±0.15＊45.25±0.23＊38.54±0.22＊＊18.71±0.26＊＊50.87±0.19＊45.93±0.12＊41.09±0.23＊31.52±0.24＊＊14.65±0.17＊＊質量濃度，μg/mL 1.25 2.5 5 10 20 1.25 2.5 5 10 20 1.25 2.5 5 10 20 EPTN組99.27±0.15 99.07±0.17 98.73±0.21 98.36±0.19 98.44±0.18 99.32±0.20 99.08±0.19 98.89±0.13 98.17±0.11 98.25±0.22 99.13±0.21 99.05±0.27 98.37±0.13 98.44±0.11 98.43±0.19 FS組88.25±0.22 86.91±0.25 84.47±0.26 79.43±0.19 68.73±0.13 86.62±0.17 85.03±0.21 81.94±0.25 75.58±0.23 62.73±0.17 75.33±0.13 68.06±0.11 60.65±0.22 57.16±0.19 48.82±0.11 RS組87.63±0.23 85.71±0.21 83.12±0.15 80.15±0.13 75.33±0.21 85.54±0.16 80.22±0.11 79.17±0.14 74.92±0.19 69.91±0.21 83.34±0.11 79.81±0.17 75.25±0.12 71.14±0.14 68.92±0.18 RPN組78.55±0.17 75.51±0.14 72.73±0.12 67.85±0.11 55.38±0.23 64.97±0.21＊61.74±0.20＊58.13±0.25＊46.32±0.21＊32.67±0.17＊58.85±0.12＊54.98±0.11 50.22±0.17 41.24±0.19 32.37±0.21＊

2.2.4 半數抑制濃度（IC50）的測定 根據各組細胞抑制率[IR（%）＝1－CV]，將同一作用時間的5個藥物濃度分別與對應的IR進行線性回歸，得到不同作用時間的IR方程。將IR＝50%代入該方程，計算IC50。各組細胞作用不同時間的IC50測定結果見表2。

表2 各組細胞作用不同時間的IC50測定結果（±s，n＝6）Tab 2 Determ ination results of IC50after cell incubated for different time in each group（±s，n＝6）

表2 各組細胞作用不同時間的IC50測定結果（±s，n＝6）Tab 2 Determ ination results of IC50after cell incubated for different time in each group（±s，n＝6）

注：與RS組比較，＊＊P＜0.01；與FS組比較，#P＜0.05Note：vs.RSgroup，＊＊P＜0.01；vs.FSgroup，#P＜0.05

RS組59.57±0.11 46.04±0.14 44.31±0.18作用時間，h 24 48 72 IC50，μg/mL RPTN組16.94±0.13＊＊4.05±0.15＊＊#0.66±0.17＊＊#RPN組24.53±0.22＊＊9.32±0.19＊＊#5.92±0.21＊＊#FS組38.10±0.27 30.01±0.29 17.44±0.17

由表2可知，在3個不同作用時間點，RPN組和RPTN組的IC50均比相應濃度、作用時間點RS組的IC50小（P＜0.01）；且在孵育24 h時，RPTN組、RPN組的細胞毒性是RS組的3.52倍和2.43倍。在孵育48、72 h時，RPN組和RPTN組的IC50均比相應濃度、作用時間點FS組的IC50小（P＜0.05）；且在孵育48 h時，RPTN組、RPN組的細胞毒性是FS組的7.41倍和3.22倍。這表明RBG納米粒對HepG2的細胞毒性強于RS和FS。

3 討論

由于RBG無熒光，故無法直觀地觀察RBG納米粒被腫瘤細胞攝取的情況。本研究制備同時包載RBG和C6的RCPTN，用以考察HepG2細胞對納米粒的攝取情況。結果可見，帶熒光的RCPTN分布在細胞核周圍，直觀地證明了RCPTN可通過細胞攝取作用將RBG和C6同時帶入肝癌細胞中，即RPTN也能通過細胞攝取作用進入細胞內部，進而發揮RBG對HepG2細胞的毒性作用。

本研究首次考察懸浮型細胞HCa-F對RCPTN的攝取情況，除HCa-F細胞形態與HepG2細胞不同外，細胞核周圍也可見RCPTN發出的熒光，證明RCPTN也能被HCa-F細胞攝取，為后續其對荷HCa-F細胞小鼠的抗腫瘤作用研究奠定了基礎。本課題組前期研究證實C6溶液無法被細胞攝取[13]，同時由于細胞的容積是有限的，故納米粒被細胞攝取量具有飽和性[14]。2種細胞與含C6的RCPTN在37下孵育4 h后，均需用PBS洗3次，以除去尚未被攝取進細胞內的納米粒，從而證明了熒光顯微鏡下觀察到的綠色熒光是細胞內的RCPTN所發出的。

體外細胞毒性試驗中，不同濃度、不同作用時間下，RPTN、RPN的CV均小于RS，表明RPTN、RPN的體外抗腫瘤活性優于RS。與體外細胞毒性試驗結合，RPTN比RS在作用24 h時具有對HepG2細胞更大的毒性是因為RBG分子跨膜吸收要經過被動擴散或主動轉運過程，進入細胞后又可能在P糖蛋白的作用下而外排，降低了RBG的抑制作用。但RPTN不需要載體轉運或濃度梯度擴散，可直接被HepG2細胞吞噬而進入細胞內，在細胞內溶酶體的作用下材料降解釋放出RBG，既能將藥物聚集在細胞內，又由于材料的緩釋性而延長藥物在細胞內的作用時間；同時載體材料PLGA-TPGS中所含的TPGS還可減少腫瘤細胞內P糖蛋白介導的多藥耐藥性（MDR）[15]，故使RBG從納米粒中釋放出來后能更好地發揮其對HepG2細胞的抑制作用。此外，不同濃度、不同作用時間下，RPTN的CV小于RPN，表明RPTN的體外抗腫瘤活性優于RPN。這是因為RPTN的載體材料PLGA-TPGS中所含的TPGS可減少腫瘤細胞內P糖蛋白介導的MDR，改善細胞膜的滲透性，從而使納米粒更易進入細胞從而發揮高效的抗腫瘤活性。其次，TPGS與PLGA合成的高分子材料PLGA-TPGS可改善PLGA的水溶性，其在細胞中釋放更快、更完全，進一步增強了RBG的抗腫瘤活性。

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（

Study on the in vitro Cell Uptake and Toxicity of Resibufogenin-loaded PLGA-TPGSNanoparticles

XU Hong1，GAO Meng2，CHU Qiuchen2，DONG Hao2，CHEN Yu3，XU Rongqian3，ZHANG Chenghong1，TIAN Yan2（1.College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China；2.College of Pharmacy，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China；3.Grade 2016 in Clinical Medical Eight Grade，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China）

OBJECTIVE：To study the in vitro uptake of Resibufogenin（RBG）lactic acid glycolic acid copolymer-water soluble vitamin E（PLGA-TPGS）in human liver cancer HepG2 cells，mouse ascites-type lymphatic metastasis of tumor HCa-F cells，and the toxicity on HepG2 cells.METHODS：RCPTN loading RBG and coumarin-6（C6）were prepared.Fluorescent inverted microscope was used to observe the in vitro uptake by RCPTN HepG2，HCa-F cells.Itwas divided into negative control group，blank PLGA-TPGS nanoparticles（EPTN）group，5-fluorouracil solution（FS）group，RBG solution（RS）group，RBG/PLGA nanoparticles（RPN）group and RPTN group.WST-1 was conducted to investigate the optical density at 450 nm wavelength of HepG2 cells after 24，48，72 h incubated by FS，RS，RPN and RPTN w ith different final concentrations（1.25，2.5，5，10，20μg/m L）；the cell viability（CV）and half inhibitory concentration（IC50）were calculated.RESULTS：RCPTN distributed around the nucleus of HepG2，HCa-F cells.CV was decreased by RBG concentration increased in RPN group and RPTN group，and decreased by time prolonged；compared w ith FS group，CV in RPTN group was decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.IC50of HepG2 cells incubated by FS，RS，RPN and RPTN was decreased by time prolonged，ordered by RS＞FS＞RPN＞RPTN；IC50incubated by RPN and RPTN for 48，72 h was obviously less than that of FS and RS（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：RPTN can deliver RBG into HepG2，HCa-F cells，show ing inhibition effect on HepG2 cellswhich is stronger than RPN，RS and FS.

Resibufogenin；Lactic acid glycolic acid copolymer-water soluble vitam in E；Nanoparticles；Liver cancer HepG2 cells；Ascites-type lymphaticmetastasis of tumor HCa-F cells；Cell uptake；in vitro cytotoxicity

R285

A

1001-0408（2017）16-2252-04

2016-09-18

2017-01-02）

（編輯：鄒麗娟）

遼寧省科學技術計劃項目（No.2015020308）

＊實驗師。研究方向：藥物制劑、藥理學、藥效學。電話：0411-86110323。E-mail：859133790@qq.com

#通信作者：教授，碩士。研究方向：藥物新制劑、新技術。電話：0411-86110420。E-mail：tiany2004@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.25