雄蠶益腎方對遲發性性腺功能低下癥大鼠睪丸組織病理變化與超微結構的影響

周 興,周 青,何清湖*

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

雄蠶益腎方對遲發性性腺功能低下癥大鼠睪丸組織病理變化與超微結構的影響

周 興1,周 青1,何清湖2*

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

目的 探討雄蠶益腎方對遲發性性腺功能低下癥（late-onset hypogonadism,LOH）大鼠睪丸組織病理變化和超微結構的影響。方法 采用“退役種鼠（40周齡）+復合情志刺激+孤養”方法，建立LOH大鼠模型，隨機分為模型組、睪酮組、雄蠶益腎方組（雄蠶組），另設立正常對照組（8周齡），藥物干預4周，末次給藥后24 h處死動物，檢測血清睪酮水平、睪丸指數，分別以光學顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察睪丸組織的病理變化與超微結構。結果 模型組、睪酮組、雄蠶組之間睪丸指數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），LOH大鼠睪丸組織出現曲細精管結構紊亂，精子大量減少，睪丸間質變少等病理變化以及線粒體數量明顯減少，大量線粒體水腫等超微結構改變，雄蠶組病理變化和超微結構均得到改善。結論 LOH大鼠可出現睪丸組織器官水平和細胞水平的病理變化及超微結構改變，雄蠶益腎方可能能通過改善其病理變化和睪丸間質細胞超微結構而發揮作用。

雄蠶益腎方；遲發性性腺功能低下癥；病理變化；超微結構

本文引用：周 興，周 青,何清湖.雄蠶益腎方對遲發性性腺功能低下癥大鼠睪丸組織病理變化與超微結構的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017,37（6）：586-590.

遲發性性腺功能低下癥（late-o nset hypogo nadism,LOH）發病主要由于增齡導致的睪酮水平進行性下降，睪酮補充替代治療 （testosterone supplementation therapy,TST）被視為LOH治療的金標準[1]，但臨床對TST療效、療程、安全性等問題仍存有爭議[2]。中醫通過辨證施治，可以綜合運用補腎、疏肝、健脾、養心等多種治法，療效肯定，為臨床LOH治療提供了新的思路。我院長期應用雄蠶益腎方治療LOH，為探索其機制，本研究觀察了該方對LOH大鼠睪丸組織病理變化和超微結構的影響，現將結果報道如下。

1 材料

1.1 動物

1.1.1 造模組大鼠 SPF級SD雄性大鼠 （退役種鼠），40 周齡，體質量（400±50） g，40 只。 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 正常對照組（以下簡稱正常組）大鼠 SPF級SD雄性大鼠，8周齡，體質量230～250 g，15只。 購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。均飼養在湖南中醫藥大學SPF級動物實驗中心，SPF級動物專用飼料飼養，恒定溫度（21±3） ℃、濕度（75±5）%，光-暗周期、動物攝食及飲水條件按造模需要設定。適應性喂養1周后進行試驗。

1.2 藥物及制備

雄蠶益腎方（雄蠶蛾30 g，淫羊藿15 g，熟地黃15 g，枸杞子 15 g，白芍 10 g，刺蒺藜 15 g），為科室協定方，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科購買并鑒定。雄蠶蛾提取工藝流程：參照劉軍等[3]提供的提取方法。乙醇提取雄蠶蛾營養活性成分的工藝條件為：乙醇體積分數45%，原料質量濃度50 g/L，提取時間30 min，提取溫度70℃。將提取液濃縮至1 g/mL。乙醇提取后的雄蠶蛾殘渣與淫羊藿、熟地黃、枸杞子、白芍、刺蒺藜合并，煎煮3次，水煎液濃縮制成含生藥濃度為1 g/mL的藥液，與乙醇提取后的雄蠶蛾液相混合，置4℃冰箱備用。

1.3 試劑及儀器

丙酸睪酮注射液：杭州動物藥品廠，2 mL/瓶，批準文號：獸藥字（2013）110201054。瑞典 LKB-III型超薄切片機，日立HT7700型透射電鏡。

2 方法

2.1 模型制備

結合課題組前期研究基礎[4]，參考金光亮[5-6]、周力[7]、于琦[8]等的復合情志刺激造模法。選擇造模用雄性SD退役種鼠（40周齡）40只，并每籠1只孤養，每日隨機給予以下不良刺激中的一種：（1）禁水（24 h）；（2）晝夜顛倒（8：00-18：00 將動物房門關上、拉下窗簾，置于黑暗環境；18：00-8：00 打開日光燈，并使房間內照度保持在 300 Lux）；（3）禁食（24 h）；（4）夾尾 （用25 mm長尾票夾在距尾端1 cm處夾住鼠尾，30 min）；（5）噪音（70 分貝，持續 2 h）。 每日 1種，每種刺激不連續使用，每周隨機休息2 d，連續4周。正常組大鼠正常條件飼養，自由攝食和飲水。

2.2 動物分組與給藥

造模完成后，斷尾采血 0.8～1.2 mL，離心管分裝，3 000 r/min，離心 10 min，分離出血清，－80 ℃冰箱冷凍保藏，ELISA法檢測血清睪酮濃度。參照參考何清湖[9]、周興[10]等的方法，統計得出15只8周齡SD雄性大鼠血清睪酮10%位數為1.91 ng/mL，以此為切點值，凡是經復合情志刺激造模后，大鼠血清睪酮水平均低于該切點值的作為LOH大鼠模型，共有34只大鼠符合納入標準。按隨機分組原則，設為模型組6只，丙酸睪酮組（以下簡稱睪酮組）6只，雄蠶益腎疏肝組（以下簡稱雄蠶組）6只；從15只正常組大鼠中隨機選取6只作為正常組。將各組大鼠分別編號標記，分籠飼養。

連續灌胃 4 周，1 次/d，上午 8：00-9：00。動物給藥劑量按動物每公斤體質量占人體表面積的比值計算，各治療組均按臨床等效劑量給藥。雄蠶組灌胃劑量為每次10 mL/kg；睪酮組每于大鼠股部肌肉注射丙酸睪酮，用量標準為7 mg/kg，每周注射3次，注射部位左右交替，共4周；模型組及正常組每次均以3 mL生理鹽水灌胃并大鼠股部肌肉注射生理鹽水，劑量按7 mg/kg。末次給藥后24 h處死所有動物，進行各項指標檢測。

2.3 樣本采集與指標檢測

烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置并離心后取上清液分裝，－80℃凍存待檢。取一部分睪丸組織置4%多聚甲醛固定，另取適量睪丸組織置2.5%戊二酸PE管內固定。

2.3.1 睪丸指數測定 取雙側睪丸置于電子天平稱質量，計算出睪丸指數。公式為：睪丸指數=雙側睪丸質量（g）/體質量（g）×100%。

2.3.2 睪丸組織病理變化 采用HE染色，光鏡下觀察各睪丸組織形態學改變。在湖南中醫藥大學病理教研室完成。

2.3.3 睪丸組織超微結構 用透射電子顯微鏡觀察睪丸間質細胞超微結構改變，在中南大學湘雅醫院電鏡室完成。

2.3.4 血清睪酮測定 采用ELISA法，根據睪酮ELISA試劑全說明書操作，在湖南師范大學生命科學院完成。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠一般情況比較

模型組、睪酮組、雄蠶組實驗前體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性；以上各組試驗后體質量比較、以及各組實驗前后體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。說明針對LOH大鼠的藥物干預，并不能影響其體質量。

模型組、睪酮組、雄蠶組各組睪丸指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。提示LOH大鼠的睪丸指數明顯低于正常組大鼠，但藥物干預并不能影響睪丸指數。見表1。

表1 4組大鼠實驗前后體重變化及睪丸指數 （±s）

表1 4組大鼠實驗前后體重變化及睪丸指數 （±s）

注：與本組治療前比較※P＜0.05；與正常組比較葒P＜0.01。

組別 n體質量（g）實驗前 實驗后 睪丸指數（%）正常組模型組睪酮組雄蠶組66 66 FP 217.03±18.68 605.15±92.27 601.37±69.33 607.70±62.67 51.26 0.00 295.63±23.07※598.55±88.94 632.83±77.33 637.70±79.34 31.39 0.00 1.15±0.10 0.55±0.06葒葒0.53±0.07葒葒0.56±0.08葒葒90.07 0.00

3.2 各組大鼠血清總睪酮水平比較

模型組、睪酮組、雄蠶組實驗前各組大鼠血清總睪酮水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性；以上各組與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

試驗后，睪酮組與模型組、雄蠶組、正常組比較，大鼠血清總睪酮水平，差異有統計學意義（P＜0.01）；雄蠶組與模型組、正常組比較大鼠血清總睪酮水平，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表2 4組大鼠實驗前后血清睪酮變化情況 （±s）

表2 4組大鼠實驗前后血清睪酮變化情況 （±s）

注：實驗前血清總睪酮滿足正態分布，但方差不齊（P=0.002），采用Tamhane’s T2檢驗。與試驗后睪酮組比較**P＜0.01；與試驗后模型組比較▲▲P＜0.01。

組別 n 血清總睪酮（ng/mL）實驗前 實驗后正常組模型組睪酮組雄蠶組6 6 6 6 FP 3.48±1.42 1.29±0.45 1.31±0.39 1.32±0.27 11.62 0.00 4.41±0.94※※1.35±0.29※※11.77±0.86▲▲2.74±1.27※※▲▲155.99 0.00

3.3 各組大鼠睪丸組織病理變化比較

正常組：各級生精細胞發育正常、層次清晰，睪丸間質正常。模型組：曲細精管結構紊亂，初級精母細胞數量減少，精子細胞壞死紊亂，大量吞噬細胞產生，精子大量減少，睪丸間質變少，細胞與細胞間分界不清。睪酮組：初級精母細胞體積變大、水腫，細胞核顏色變淺，分界不清，睪丸間質萎縮變少。雄蠶組：少量生精細胞脫落，曲細精管無萎縮，睪丸間質無水腫。見圖1。

3.4 各組大鼠睪丸組織超微結構改變比較

正常組：線粒體數量多，線粒體聚集，形成線粒體鞘，線粒體體積大，線粒體嵴清晰，線粒體無水腫。模型組：線粒體數量明顯減少，大量線粒體水腫，線粒體體積小，線粒體嵴不清晰，嵴水腫、擴張，出現空泡樣變。睪酮組：與雄蠶組、正常組比較，線粒體數量減少，部分線粒體水腫，線粒體體積小，部分線粒體嵴清晰。雄蠶組：線粒體數量多，部分可看到線粒體鞘形成，線粒體體積較大，線粒體嵴尚清晰，線粒體水腫不明顯。見圖2。

圖1 HE染色觀察睪丸組織形態光鏡圖

圖2睪丸組織超微結構改變電鏡圖

4 討論

LOH的發病主要與年齡相關的睪酮水平下降有關，作為睪酮合成的最關鍵細胞——睪丸間質細胞（Leydig cell），其合成功能隨增齡衰退的調控是目前LOH研究重要方向之一。增齡影響的具體機制可能有[11]：（1）膽固醇轉運蛋白減少，主要有類固醇激素合成急性調節蛋白（StAR）、外周型苯二氮卓受體轉運蛋白（TSPO），進而影響游離膽固醇經線粒體外膜向線粒體內膜轉運；（2）睪酮合成酶活性下降，包括位于線粒體內膜的細胞色素膽固醇側鏈裂解酶（P450scc）和位于滑面內質網的3β-羥甾脫氫酶（3β-HSD）。也有證據表明，Leydig細胞睪酮合成功能衰退可能與增齡相關的超微結構改變有關。如李維仁等[12]證實，老年人睪丸間質細胞胞漿中，細胞器較少，可見大量腫脹線粒體，線粒體嵴消失，少見有脂滴；邵迎紅等[13]研究證實，24月齡SD大鼠睪丸間質細胞線粒體、滑面內質網減少，線粒體腫脹，板狀嵴模糊、消失，內質網擴張，有不同程度的局灶性到彌漫性囊泡變性，內質網廣泛擴張的細胞呈篩狀。本研究發現，模型組大鼠Leydig細胞線粒體數量明顯減少、大量線粒體水腫等改變，與上述結果一致。睪酮合成過程中，Leydig細胞線粒體是最關鍵細胞器之一，因為關鍵限速酶StAR、P450scc，都存在于Leydig細胞線粒體內膜。線粒體水腫等上述改變是否與睪酮合成酶活性下降相關？又是哪些因素導致了Leydig細胞線粒體水腫的發生呢？

進一步文獻研究，我們認為：一方面，Leydig細胞線粒體腫脹等超微結構改變，可能與增齡導致的活性氧簇（ROS）在Leydig細胞蓄積有關。真核細胞線粒體是產生ROS的最主要部位。根據目前較公認的“氧自由基衰老學說”，增齡相關的細胞衰老與細胞內ROS蓄積，氧化應激相關。已有的研究證實，在衰老進程中，ROS在Leydig細胞內蓄積，將導致Leydig細胞凋亡增加[14]、線粒體功能紊亂[15]；同時，ROS還可通過介導c-Jun信號通路抑制Nur77轉錄，進而降低睪酮合成酶基因表達[16]。

另一方面，Leydig細胞線粒體腫脹等超微結構改變，可能與增齡導致的Leydig細胞自噬下降有關。自噬是細胞內某些物質成分被自身溶酶體包裹降解的過程，能凈化自身多余或受損的細胞器，維持細胞自穩。早在上世紀80～90年代，國內有研究報道，生理情況下Leydig細胞自噬非常活躍，是研究自噬的很好細胞模型，并提出自噬可能對Leydig細胞睪酮的合成有調節作用[17]。近年來研究證實，與青年組（3月齡）大鼠比較，老年組（24月齡）大鼠睪酮水平下降、Leydig細胞自噬降低、StAR蛋白表達下調；進一步研究發現，敲除TM3 Leydig細胞自噬關鍵基因Beclin1后，Leydig細胞自噬顯著降低，LC3-Ⅱ蛋白（LC3-磷脂酰乙醇胺共軛，自噬蛋白標志物）和StAR蛋白表達均下調[18]。說明自噬降低與老年大鼠Leydig細胞睪酮合成水平下降直接相關。

本研究證實，雄蠶益腎方能提高LOH大鼠血清睪酮水平，顯著降低Leydig細胞線粒體水腫發生，是否與影響Leydig細胞ROS蓄積、增加自噬有關？具體機制仍需要進一步研究證實。因此，圍繞Leydig細胞超微結構改變，探索雄蠶益腎方干預LOH的可能分子機制研究，將是研究團隊下一步研究的重點。

[1]Comhaire F,Mahmoud A.The andrologist's contribution to a better life for ageing men：part 1.Andrologia,2016,48(1)：87-98.

[2]Mascarenhas A.Khan S.Sayal R.et al.Factors that may be influencing the rise in prescription testosterone replacement therapy in adult men：a qualitative study.Aging Male,2016,19（2）：1-6.

[3]劉 軍,廖森泰,鄒宇曉,等.雄蠶蛾營養活性成分的提取方法及工藝條件優化.蠶業科學,2013,39(1)：146-151.

[4]周 興，何清湖，周 青，等.腎虛肝郁證遲發性性腺功能減退癥大鼠模型的建立與評價.湖南中醫藥大學學報，2016，36（3）：30-35.

[5]金光亮,南 睿,郭霞珍.慢性應激肝郁證大鼠模型的建立.北京中醫藥大學學報,2003,26(2)：18-21.

[6]金光亮,王勝蘭.關于建立肝郁證動物模型的思考.山東中醫藥大學學報,2004,28(6)：408-409.

[7]周 力,蒲 琴,申 理,等.利用不良情志刺激建立肝郁證動物模型初探.中藥藥理與臨床,2008,24(3)：114-115.

[8]于 琦,金光亮.四逆散、歸脾湯與溫膽湯對慢性應激肝郁模型大鼠行為學的影響.廣州中醫藥大學學報,2009,26(2)：148-151.

[9]何清湖,周 興.環磷酰胺復制中老年男性雄激素部分缺乏綜合征大鼠模型的研究.湖南中醫藥大學學報,2011,31(1)：15-17.

[10]周 興,何清湖,劉朝圣,等.天蠶壯陽散對中老年男性雄激素部分缺乏綜合征模型大鼠睪丸間質細胞stAR蛋白表達的影響.中國中西醫結合雜志,2011,31(4)：542-546.

[11]Beattie MC,Adekola L,Papadopoulos V,et al.Leydig cell aging and ypogonadism.Exp Gerontol,2015,68：87-91.

[12]李維仁,韓勃萱,劉 濤,等.老年人睪丸間質細胞結構及StAR和P450scc蛋白表達的變化.北京大學學報 (醫學版),2011,43(4)：505-508.

[13]邵迎紅,母義明,李江源,等.衰老大鼠睪丸間質細胞形態學觀察.中國男科學雜志,2005,19(2)：10-12.

[14]Ding X,Wang D,Li L,et al.Dehydroepiandrosterone ameliorates H2O2-induced Leydig cells oxidation damage and apoptosis through inhibition of ROS production and activation of PI3K/Akt pathways.Int J Biochem Cell Biol,2016,70：126-139.

[15]DiemerT,Allen JA,Hales KH,etal.Reactive oxygen disrupts mitochondria in MA-10 tumor Leydig cells and inhibits steroidogenic acute regulatory (StAR)protein and steroidogenesis.Endocrinology,2003,144(7)：2882-2891.

[16]Lee SY,Gong EY,Hong CY,et al.ROS inhibit the expression of testicular steroidogenic enzyme genes via the suppression of Nur77 transactivation.Free Radic Biol Med,2009,47(11)：1591-1600.

[17]湯雪明,張蕙心,易 靜.睪丸間質細胞——研究自體吞噬的一種正常細胞模型.實驗生物學報,1992,25(1)：39-47.

[18]Li WR,Chen L,Chang ZJ,et al.Autophagic deficiency is related to steroidogenic decline in aged rat Leydig cells.Asian J Androl,2011,13(6)：881-888.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Xiongcan Yishen Prescription on Pathological Changes and Ultrastructure of Testicular Tissue in the Late-Onset Hypogonadism Rats

ZHOU Xing1,ZHOU Qing1,HE Qinghu2*
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To study the effects of Xiongcan Yishen formula on the pathological changes and the ultrastructure of the testicular tissue in the late-onset hypogonadism (LOH)rats.Methods The LOH rat models were established by using retired mated rats (40 weeks)which fed separately and given various emotional stimulation.The rats were randomly divided into model group,testosterone group,Xiongcan group,and establishment of control group (8 weeks),the medicine intervention was for 4 weeks.The rats were sacrificed 24 hours later after last medication.The serum testosterone and testicle mass index was detected,the ultrastructure and pathological changes of the testicular tissue were observed by opticalmicroscope and transmission electron microscope.ResultsThe rattesticularindexesbetween modelgroup,testosterone group,Xiongcan group were significantly different (P ＞0.05).The LOH model rats have the following pathological changes such as structure disturbance of seminiferous tubules,spermatogenesis loss,testis interstitial loss,and the ultrastructural changes such as mitochondria decreases and obvious edema of mitochondria.The pathological changes and the ultrastructures in Xiongcan group were improved.Conclusion LOH rats appear the pathological changes and the ultrastructural changes of the testicular tissue at the organic level and the cellular level.Xiongcan Yishen prescription could ameliorating its pathological changes and the ultrastructural changes of leydig cells.

Xiongcan Yishen prescription;late-onset hypogonadism;pathological changes;ultrastructure

R285.5；R588

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2017.06.002

2016-08-08

國家自然科學基金（81202706，81673984）；湖南省教育廳優秀青年項目（16B200）。

周 興，男，副主任醫師，博士，從事中西醫結合男科學專業研究。

* 何清湖，男，教授，博士研究生導師，E-mail：hqh1111@tom.com。