視網膜色素上皮細胞光損傷模型的建立與評估

羅向艷，羅 萍*，顏家朝，李傳課，李 波，陳向東

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科，湖南 長沙 410007)

視網膜色素上皮細胞光損傷模型的建立與評估

羅向艷1，羅 萍2*，顏家朝2，李傳課2，李 波2，陳向東2

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院眼科，湖南 長沙 410007)

目的 通過不同光照時間和光照強度，探索建立最佳視網膜色素上皮細胞光損傷模型,為視網膜光損傷細胞造模方法提供理論依據。方法 選取原代大鼠視網膜色素上皮細胞和大鼠視網膜色素上皮細胞系,LED白色冷光燈模擬自然光源，選取(2 500、5 000、7 500、10 000 Lux)作為光照強度，以不同光照時間(6、12 h)對細胞進行照射，建立光損傷模型,鏡下觀察細胞形態,采用MTT法檢測細胞活力。結果 光照處理后，RPE細胞活力受到抑制，隨著光照強度及時間增強,細胞活力降低明顯,原代細胞 6 h 7 500、10 000 Lux 和 12 h 5 000、7 500、10 000 Lux,細胞系 6 h 10 000 Lux 和 12 h 7 500、10 000 Lux,視網膜色素上皮細胞活力均低于空白組(P＜0.01)。結論 RPE細胞活力受光照時間及強度抑制,原代細胞較細胞系對光損傷更敏感。

視網膜色素上皮細胞;光損傷;光照時長;光照強度；原代細胞；細胞系

視網膜光損傷主要包括三種：機械損傷、光化學損傷、熱損傷,三種損傷方式各不同,光化學損傷是視網膜光損傷主要方式之一[1]。伴隨著社會發展,燈光的大量使用、高科技儀器和電子產品盛行,增加了視功能的損傷,長期接觸導致眼底病變,臨床上常見的眼底視網膜疾病，如年齡相關性黃斑變性等均與光照過度有關[2]。近幾十年里,針對視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells,RPE細胞)光損傷進行過大量的實驗研究,大部分實驗基于長時間低強度和細胞系的研究,甚至根據不同波長進行光損傷研究[3-6]。為全面探索RPE細胞光損傷模型及實驗進一步研究,我們通過不同光照時間和光照強度，建立最佳RPE細胞光損傷模型,為視網膜光損傷細胞造模方法提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

大鼠視網膜色素上皮細胞系 (購自上海賽齊生物工程公司)，原代大鼠視網膜色素上皮細胞(購自上海賽齊生物工程公司)，MTT細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒(購自貝博生物公司)，DMEM培養基、胎牛血清、胰酶消化液(購自Invitrogen公司)，倒置顯微鏡 (OLYMPUS IX71)，CO2恒溫培養箱(SANYO)，Smart spec 3 000型酶聯免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)，自制直落式LED白色冷光燈。

1.2 方法

1.2.1 細胞的復蘇、傳代及培養 細胞復蘇：將有1 mL細胞懸液的凍存管放在37℃水浴中,振蕩解凍，加10 mL DMEM培養液混合均勻,在1 000 RPM轉速下離心4 min，棄除上清液，補加1～2 mL DMEM培養液后吹勻,然后將所有細胞懸液加入含有5mL完全培養基的培養瓶中靜置培養,在37℃，5%CO2，90%濕度的培養箱中培養，48 h后換液并檢查細胞密度,待細胞貼壁后，每3天換液1次，直到細胞融合，行1∶2傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態改變，選擇1～2代對數生長期細胞，制備成單細胞懸液,細胞系復蘇同方法[7]。

細胞傳代：如果細胞密度達80%～90%，既可進行傳代培養：棄去培養液，用不含鈣、鎂離子的PBS洗 1～2次,加入 2 mL 0.25%胰蛋白酶，消化 15 min,置于37℃培養箱中2 min，然后在倒置顯微鏡下觀察細胞消化狀況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲培養瓶，后加10 mL小牛血清終止消化,按3 mL/瓶補加完全培養基，輕敲打勻后吸出，在1 000 r/min轉速下離心4 min，棄除上清液，補加2 mL完全培養液后吹勻,將細胞懸液按1∶2到1∶5的比例分到新的含5 mL完全培養基的培養瓶中,在37℃，5%CO2，90%濕度的培養箱中培養，48 h后換液并檢查細胞密度,待細胞貼壁,直到細胞融合，制備成單細胞懸液,細胞系傳代同方法。

1.2.2 構建細胞光損傷模型及分組 將制備好的單細胞懸液培養于96孔培養板內,每組6孔，每孔100 μL， 置 37 ℃、5%CO2培養箱內培養 12 h，待細胞貼壁后進行實驗,以白色LED冷光燈作光源，采取直落式照射，光照在培養箱內密閉進行，無自然光干擾，測定光照強度，調整光源與培養板之間的距離，使被照細胞同一水平的光照強度（2 500、5 000、7 500、10 000 Lux）相同，用上述光照器照射細胞6、12 h，作為光損傷模型組，同時設立空白對照組，不作光照處理。

1.2.3 鏡下觀察細胞形態改變 倒置相差顯微鏡下觀察正常對照組和不同光損傷模型組的細胞貼壁情況及形態學變化。

1.2.4 MTT檢測細胞活力 各組細胞在檢測時間點時，每孔加10 uL MTT溶液，在37℃、5%CO2培養箱中培養4 h。選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上檢測各孔光吸收值，記錄結果為：光照強度為橫坐標，吸光值為縱坐標,最終繪制細胞生長圖。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 鏡下觀察細胞形態

培養的原代大鼠RPE細胞和大鼠RPE細胞系,大小均一、呈圓形、富含黑色素，細胞貼壁后變扁平，伸出偽足，呈不規則形態，可見清晰透明細胞核，細胞呈現集簇融合樣生長。細胞融合后呈多種形態改變，圓形、梭形或不規則形態,細胞黑色素隨傳代次數增加而減少，逐漸至透明，在各光照組的孔板中，細胞量隨時間及強度的增加而減少。原代細胞6 h 2 500 Lux和12 h 5 000 Lux，細胞系6 h 10 000 Lux和12 h 7 500 Lux,其中部分細胞拉長或崩解，偶見細胞浮起，細胞量明顯減少，折光性減弱，鏡下見對照組細胞呈圓形或橢圓形，細胞周圍可見豐富微絨毛，胞質內可見大量游離核糖體，偶見黑色素顆粒，細胞核內見數個核仁，細胞間見細胞連接體。

2.2 MTT 檢測細胞活力

RPE細胞使用不同時間（6、12 h）和不同光照強度（2 500、5 000、7 500、10 000 Lux）進行光損傷造模處理，白色LED光源置于細胞培養箱內。結果顯示，光照處理后，RPE細胞活力受到抑制，細胞受到白光的損傷,隨著光照強度增強，細胞活力降低明顯。原代細胞6 h 7 500、10 000和12 h 5 000 Lux、7 500、10 000 Lux, 細胞系 6 h 10 000 Lux和12 h 7 500、10 000 Lux,RPE細胞活力與均低于空白組，差異有顯著統計學意義(P＜0.01);原代細胞與細胞系對比,光照時長及強度均低,對光損傷更敏感。見表1。

表1不同光照強度、時間對RPE的細胞系和原代細胞活力影響勤 （±s，n=3,吸光值）

表1不同光照強度、時間對RPE的細胞系和原代細胞活力影響勤 （±s，n=3,吸光值）

注：與空白組比較，*P＜0.05,**P＜0.01。

分組細胞系 原代細胞6 h 12 h 6 h 12 h空白組2 500 Lux 5 000 Lux 7 500 Lux 10 000 Lux FP 0.818±0.027 0.818±0.009 0.742±0.019 0.691±0.024 0.414±0.011**225.405 0.000 1.230±0.059 0.981±0.036 0.841±0.035 0.620±0.021**0.576±0.025**151.222 0.000 0.758±0.026 0.723±0.019 0.679±0.028 0.512±0.018**0.415±0.030**109.605 0.000 1.156±0.104 0.967±0.020 0.761±0.040**0.633±0.025**0.576±0.025**62.702 0.000

3 討論

光損傷是由于過強的光照射或者長時間直視光源對視網膜造成的損傷。視網膜是眼睛接受光能、產生視覺的重要組織結構,同時,也是眼組織中最容易受光損害的重要部位[1]。在近30年中,許多研究人員利用各種實驗動物進行了大量有關視網膜光損傷及其機制的研究探索。其中，國外關于LED輻射對人類視網膜色素上皮細胞的影響進行了大量研究。結果表明：在12 h輻射中可減少細胞生存能力75%～99%，并增加66%～89%的細胞凋亡，同時還增加活性氧產量和DNA損傷，未照射細胞的凋亡是3.7%[8]。國內視網膜色素上皮細胞光損傷研究集中在通過轉換成光照度研究，且大部分實驗選擇大鼠RPE細胞系及長時間低強度光照。

本實驗使用白色LED冷光燈作光源，通過延長光照時間及采用低中高強度,模擬日常生活光照時間及強度，選擇原代細胞與細胞系對照，探索視網膜光損傷模型建立。實驗結果顯示，原代細胞6 h 7 500、10 000 Lux 和 12 h 5 000、7 500、10 000 Lux 組,細胞系 6 h 10 000 Lux和 12 h 7 500、10 000 Lux組，兩者造模均成功。表明RPE細胞活力受光照時間及強度抑制，時間越長強度越大，抑制越明顯。原代細胞比細胞系光照時長及強度均低,對光損傷更敏感。從結果中得出,原代細胞在一定程度上更符合人眼視網膜色素上皮細胞狀態，更適合光損傷模型的選擇。已知原代培養的細胞是組織剛剛離體，生物性狀尚未發生明顯變化，一定程度上能反映體內狀態，具有特異性，是進行光損傷研究的優選材料。細胞系是不斷生長、分化的細胞群，因其經過遺傳改造，生存穩定性強，致使其具有無限增長的潛能,同時,原代細胞保留細胞系所沒有基因，細胞系在傳代過程中會丟失部分基因，所以使用原代細胞研究細胞凋亡更有實驗意義。

視網膜色素上皮細胞對視網膜的健康至關重要，它們容易受到過度光損傷而衰老死亡。視網膜光損傷模型的理論研究目前取得了進展，但其根本機制仍不十分清楚,隨著視網膜光損傷機制認識的不斷加深，建立良好的視網膜光損傷模型至關重要,將為視網膜光損傷的研究奠定實驗基礎。

[1]彭 華,董 玉.視網膜光損傷發生機制及治療研究進展[J].中國中醫藥,2013,11(9)：162-165.

[2]Kent M， Neubauer AS， Liegl RG， et al.Sorafenib prevents human retinal pigment epithelium cells from light-induced overexpression of VEGF， PDGF and PIGF[J].Br J Ophthalmol，2010， 94(11)：1533-1539.

[3]Yi xiang Liu,Di Zhang,Yongpei Wua,et al.Docosahexaenoic acid aggravates hotooxidative damage in retinal pigment epithelial cells via lipid peroxidation[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology.2014(140)：85-93.

[4]Yong Wang,Di Zhang,Yi Xiang Liu,et al.The protective effects of berry-derived anthocyanins against visible light-induced damage in human retinal pigment epithelial cells[J].SCI.6 June 2014.

[5]Yixiang Liu,Xue Song1,Di Zhang,et al.Blueberry anthocyanins：protection against ageing and light-induced damage in retinal pigment epithelial cells[J].British Journal of Nutrition[J].(2012),108,16-27.

[6]Kazuhiro Tsuruma,Yuhei Nishimura,Seiya Kishi,et al.SEMA4A Mutations Lead to Susceptibility to Light Irradiation,Oxidative Stress,and ER Stress in Retinal Pigment Epithelial Cells[J].Retinal Cell Biology.2012,53(10)：6729-6737.

[7]林少芬,毛羽翔.人視網膜色素上皮細胞原代培養凍存和復蘇方法改進[J].實用醫技雜志,2012,8(19)791-793.

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（本文編輯 楊 瑛）

Establishment and Evaluation of Light-Induced Retinal Pigment Epithelial Cells Damage Models

LUO Xiangyan1,LUO Ping2,YAN Jiachao2,LI Chuanke2,LI Bo2,CHEN Xiangdong2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To establish the best light-induced retinal pigment epithelial cells damage models through different light application time and light intensity,explore,and provide the theoretical basis for building this model.Methods The primary retinal pigment epithelial cells and cell lines in rats were selected,LED cold light lamp simulate natural white light source,select 2 500,5 000,7 500,10 000 lux as light intensity,with different illumination time(6 h,12 h)irradiation on cells,light damage model was established.The cell morphology was observed by microscope,cell vitality was determined by MTT method.Results After light treatment,RPE cell vitality was restrained.The cell vitality reduced obviously with increasing intensity and time of light.The cell vitality of primary cell at 6 h 7 500,10 000 lux,12 h 5 000,7 500,10 000 lux,cell line at 6 h 10 000 lux and 12 h 7 500,10 000 lux,was lower than the blank group,there are significant differences(P＜0.01).Conclusion Retinal pigment epithelial cell vitality is inhibited by the time and intensity of light.The primary cell is more sensitive than cell lines on light-induced damage.

retinal pigment epithelial cells;light-induced damage;illumination time;light intensity;primary cell;cell line

R779.1；R965.1

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2017.06.005

本文引用：羅向艷，羅 萍，顏家朝，李傳課，李 波，陳向東.視網膜色素上皮細胞光損傷模型的建立與評估[J].湖南中醫藥大學學報，2017,37（6）：599-601.

2016-12-06

國家自然科學基金青年基金項目（81303007/H2713）；國家中醫藥管理局全國名老中醫藥專家李傳課傳承工作室（國中醫藥人教發2013（47）號）。

羅向艷，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫藥治療眼底病。

*羅 萍，女，主任醫師，中醫藥防治眼底病的研究，E-mail：381526630@qq.com。