基于電項針對失眠大鼠下丘腦免疫細胞因子影響的實驗研究

吳建麗，杜冬梅，史文強，王天琪，于 杰，王永亮，梅榮軍*

（1.黑龍江中醫藥大學針灸研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學研究生學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

基于電項針對失眠大鼠下丘腦免疫細胞因子影響的實驗研究

吳建麗1，杜冬梅2，史文強3，王天琪2，于 杰2，王永亮3，梅榮軍3*

（1.黑龍江中醫藥大學針灸研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學研究生學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

目的 觀察不同頻率電項針對睡眠剝奪大鼠下丘腦內免疫因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量的影響，明確電項針對失眠的治療作用，并探討其發揮促眠效應的可能作用機制。方法 將50只健康雄性Wistar大鼠隨機分成空白組、模型組、2 Hz刺激組、50 Hz刺激組、100 Hz刺激組，每組10只。采用對氯苯丙氨酸（PCPA）化法制作失眠大鼠模型。造模成功后，各頻率刺激組連續1周進行電項針干預治療，1次/日，30 min/次，空白組和模型組每日在相應時間仿照刺激組固定軀體，不進行任何處置。各組于治療結束后處死大鼠后迅速分離下丘腦組織，運用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定IL-1β、IL-6和TNF-α含量。結果 模型組大鼠下丘腦中IL-1β、IL-6和TNF-α濃度明顯低于空白組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，各頻率刺激組IL-1β、IL-6和TNF-α濃度均升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；各頻率刺激組之間比較，2 Hz刺激組下丘腦 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 含量高于 50 Hz和 100 Hz組（P＜0.05），50Hz組和100Hz組間比較無統計學差異（P＞0.05）。結論 不同頻率電項針治療失眠均有效，各頻率組電項針治療比較，2Hz刺激組的促眠作用最好，其促眠作用的機制可能與調節下丘腦內免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量相關。

睡眠剝奪；電項針；免疫細胞因子；PCPA

失眠，在《內經》被認為是“目不瞑”“不得眠”，《難經》開始被稱為“不寐”，其主要的病因病機為陰陽失調、營衛失和及臟腑不調。其主要表現為難以入睡、熟睡維持困難和醒后不能恢復精力和體力，從而干擾白天的生活和工作，長期慢性失眠還可引發焦慮、抑郁等情感問題或誘發心腦血管疾病。流行病學表明[1]，我國普通人中45.4%存在失眠問題，美國為32～35%，日本為21%。針灸治療失眠有見效快、效果好、成本低及副作用少的特點，近年來對其療效的臨床研究和機制的實驗研究方面均取得了一定成果[2]。有學者發現[3]，免疫調節因子可以作用于特定的中樞結構影響睡眠和覺醒狀態，其在腦內的含量也隨著睡眠進程呈節律性改化。白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是被實驗證明的與睡眠-覺醒周期有確切關系的細胞因子[4]，在睡眠的調節中有重要作用，故本實驗選取項部“風池”和“供血”穴，通過不同頻率電項針對睡眠剝奪大鼠的干預，觀察電項針對大鼠下丘腦組織內IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響，探討電項針促眠效應的機制及不同頻率電項針的效果差異。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康成年Wistar大鼠50只，雄性，體質量210～230 g，清潔級，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部供應，生產許可證號：SCXK(黑)2013-001。采用隨機數字表法分為空白組、模型組、2 Hz刺激組、50 Hz刺激組和100 Hz刺激組，每組各10只，采用苦味酸染色標記編號。實驗過程中對動物處置均符合動物倫理標準。

1.2 試劑及儀器

氯苯丙氨酸（PCPA）購自Sigma公司，Maya公司分裝，批號：MAYA-CR-5025；大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒均購自南京建成生物研究所，生產批號均為201604；水合氯醛購自天津市凱通化學試劑有限公司，批號：20141122；6805-AⅡ型電針治療儀購自汕頭市醫用設備廠有限公司；VERSA max酶標儀購自購自美國Molecular Devices公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司；XS105型精密分析天平購自梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；HHS21-6電熱恒溫水浴鍋購自上海躍進醫療器械廠；一次性針灸針購自北京中研太和醫療器械有限公司，批號：331526。

1.3 模型制備

適應性喂養1周后，根據文獻報道[5-6]，本實驗采用PCPA法制備大鼠失眠模型。將PCPA粉末按30 mg/mL溶于弱堿性生理鹽水，并用超聲波振蕩器促進藥物溶解。除空白組外，余下各組每日上午9：00腹腔注射 PCPA，劑量為 10 mL/kg，1次/d， 連續2 d。大鼠于第1次注射28～30 h后，有以下行為表示造模成功：晝伏夜行節律消失，白天活動不停，對周圍聲音、光刺激敏感，易激惹，興奮性增高，容易嘶叫打斗，飲食和二便明顯增多，整體觀察與空白組明顯不同。

1.4 實驗方法

模型復制成功以后，于第2日上午將大鼠四肢和軀體固定，空白組和模型組不做任何處置，各頻率刺激組常規消毒，選取0.25 mm×25 mm無菌性毫針刺入雙側的“風池”和“供血”穴，將導線連接于針柄，同側腧穴上下相連，刺激頻率分別為2 Hz、50 Hz和100 Hz的連續波，刺激強度為1 V，1次/d，30 min/次，連續治療 7 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 標本制備 末次治療后，5組大鼠采用頸椎脫臼法處死，分離出完整的腦組織放入冷生理鹽水中洗去血液，在冰盒上迅速剝離出下丘腦，稱質量后放入標記好的EP管內，快速冰凍于液氮中1 min，放入-80℃冰箱保存備用。測定時，在冰浴環境下，將下丘腦與生理鹽水按1∶9的比例充分勻漿、離心（4 ℃，6 000 r/min，15 min），取上清液待用。應用 ELISA法測定下丘腦內 IL-1β、IL-6和 TNF-α的含量，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 標準曲線 以說明書確定標準物的5個濃度為橫坐標，兩個標準孔吸光度（OD）平均值值為縱坐標，作直線回歸標準曲線，求得三個免疫因子的直線回歸方程和相關系數R分別為：IL-1β y=0.033 6x+0.147 6，R2=0.981 7； IL-6 y=0.018 1x+0.071 1，R2=0.961 4； TNF y=0.007 7x+0.035 5，R2=0.934 9。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠行為學改變

空白組大鼠在實驗前后睡眠、飲食和二便無明顯差異。余下各組大鼠注射PCPA后睡眠周期紊亂，總睡眠時間顯著減少，白天活動不停，攻擊性增強，對外界的光學、聲學敏感性增加，易受驚。模型組大鼠在造模第9天，即電項針組治療最后1天仍出現白天活動頻繁、煩躁、毛色蓬亂無澤、飲食及二便增多等興奮性行為。各電項針治療組在治療后期較模型組安靜，活動量少，蜷臥、毛色光潔，飲水進食二便逐漸恢復正常。

2.2 各組大鼠不同時間點體質量改變情況

分組和造模時各組大鼠體質量無顯著差異，均正常生長（P＞0.05）。 針刺第 1 天（即造模第 3 天）各組大鼠體質量有顯著性差異，模型組及各刺激組體質量在造模后較正常組均明顯減輕（P＜0.05）。治療結束后，模型組大鼠與空白組比較，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），2 Hz和 50 Hz刺激組體質量顯著增加，與空白組和模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），100 Hz 刺激組體質量雖有增加，與空白組比較，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01），但與模型組比較無明顯差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1各組大鼠不同時間點體質量的變化 （±s，g）

表1各組大鼠不同時間點體質量的變化 （±s，g）

注：與空白組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05。

組別空白組模型組2 Hz刺激組50 H刺激組100 Hz治療組n 10 10 10 10 10分組時217.45±5.63 220.14±5.28 218.66±7.94 221.17±7.91 218.50±8.16造模時227.72±7.45 231.16±4.35 229.97±9.63 231.99±6.27 228.38±8.58針刺第1天231.18±9.24 221.36±9.15▲220.53±6.19▲221.86±8.53▲219.61±5.81▲針刺第7天242.49±6.53 221.09±8.13▲▲229.85±4.61▲△226.33±6.35▲△222.42±7.84▲▲

2.3 各組大鼠下丘腦內IL-1β、IL-6和TNF-α 含量比較

治療結束后，與空白組比較，模型組大鼠下丘腦中IL-1β、IL-6和TNF-α濃度明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，各頻率刺激組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）；各頻率刺激組之間比較，2 Hz 刺激組下丘腦IL-1β、IL-6和TNF-α含量高于50 Hz和 100 Hz組 （P＜0.05），50 Hz組和 100 Hz組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

3 討論

表2各組大鼠下丘腦內IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較 （n=10，±s，ng/L）

表2各組大鼠下丘腦內IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較 （n=10，±s，ng/L）

注：與空白組比較 ＃P＜0.05；與模型組比較▲P＜0.05，與 2 Hz 刺激組比較△P＜0.05。

組別空白組模型組2 Hz刺激組5 0 Hz刺激組100 Hz刺激組IL-1β 112.31±8.97 73.28±6.63＃108.36±7.28▲91.67±5.91▲△86.48±5.76▲△IL-6 224.52±17.45 162.15±12.35＃208.37±10.63▲188.92±13.27▲△186.34±11.58▲△TNF-α 137.28±11.24 65.44±13.15＃132.17±10.53▲113.46±14.81▲△100.53±12.53▲△

中醫學認為人體內環境是一個有機的整體，睡眠與人體的氣血經脈運行緊密相連。《靈樞·大惑論》曰：“衛氣不得入于陰，常留于陽……故目不瞑矣?！痹凇秲冉洝防碚摰闹笇?，近代醫家認為陽不入陰、營衛失和是導致失眠的主要發病機制[7-9]?，F代醫學認為睡眠是人體自發的一種規律性的自我保護機制，睡眠-覺醒周期是與大自然晝夜節律相適應的表現。失眠的原因多種多樣，有軀體生理心理變化或病理異常等內源性因素[10]，也有睡眠不良習慣、環境及食物等外源性因素，其發生與腦供血不足、腦干上行網狀結構激活和抑制系統失衡、腦內免疫調節功能異常密切相關[11]。

電項針療法是高維濱教授總結出來治療腦血管疾病、神經功能性疾病的一種方法，在臨床中可以治療許多與椎基底動脈、腦干網狀結構相關的疾病[12]，尤其在治療失眠病中效果顯著[13-14]。本法選取的穴位為項部兩側的“風池”和“供血”穴，風池穴屬足少陽膽經，位于椎基底動脈附近，針刺此穴可以增加腦血流量，調節腦血管運動平衡；供血穴是高教授發明的改善腦供血不足的特異性腧穴，位于人體風池穴下1.5寸，二穴聯合應用，共同改善腦部供血功。同時此二穴的基礎上，通以脈沖電流，經腦干網狀結構恢復大腦皮層興奮與抑制的過程，從而取得治療失眠的效果。

研究表明，健康成年人在完全剝奪睡眠40 h后，血漿內IL-1β的含量隨著睡眠剝奪時間的延長而增加[15]。動物睡眠被剝奪72 h后，下丘腦炎癥基因芯片分析發現IL-1β表達水平較對照組升高2.55 倍，且內源性 IL-1β 蛋白表達也顯著升高[16]，而在中縫背核外源補充IL-1β后，可以延長非快速眼動睡眠（NREMS）時程[17]，其機制可能是通過抑制5-羥色胺能神經元功能調節睡眠。IL-6是一種多功能細胞因子，可作為睡眠因子來調節睡眠。臨床報道[18]，原發性失眠患者，睡眠時間越短、深度越淺，血清中IL-6水平越高。實驗研究表明，IL-6基因敲除小鼠24 h記錄期內快速眼動睡眠（REMS）期較正常組多出約30%的時間，而給健康人用重組人IL-6后則可發生REMS明顯減少，同時出現白天疲倦，注意力不集中等表現[19-20]。TNF除參與炎癥反應外，與機體的睡眠、大腦發育、內分泌功能密切相關。研究表明[21]，外源性注射TNF可增多大鼠的NREMS時間，呈劑量依賴性增多。文獻顯示[22]，IL-1與TNF能相互誘導對方的產生，兩者可能來于同一基因組，抑制其中一方功能則影響另一方誘導NREMS，但基因敲除實驗發現二者可獨自影響睡眠過程。這些文獻資料提示從細胞因子水平改變機體免疫功能角度，以下丘腦內IL-1β、IL-6和TNF作為檢測指標探討電項針對睡眠的調節機制是有依據可循的，有重要的研究價值。

針灸補瀉原則是“盛則瀉之，虛則補之”，研究發現電針參數如頻率、波形、電流強度不同，其產生生理效應及補瀉作用也不同。一般認為頻率慢，電流小，刺激弱的為補法，反之為瀉法。失眠的病機為陰盛陽虛，大腦皮層興奮性與抑制性失衡，表現為白天興奮性降低抑制性提高，夜間則相反。筆者臨床實踐發現，白天采用低頻補法可以提高大腦皮層的興奮性，有效的恢復大腦皮層興奮和抑制的平衡，改善失眠狀態。研究發現，電針可對睡眠期間腦電波的4種波形產生影響，閻克樂等[23]給正常健康人1～2 Hz的電針刺激1 h，結果16個測量部位中有6個部位的δ波增加，14個部位的θ增加，α波則相對減少，而困倦是與腦電的θ波聯系在一起的，δ波更是深度睡眠出現的波形，所以采用2 Hz低頻波治療失眠也是有依據可循的。

本實驗結果顯示，模型組下丘腦內IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯低于空白組，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示造模后細胞因子含量失調是導致大鼠失眠的原因之一；經過電項針治療后，與模型組比，各頻率刺激組下丘腦IL-1β、IL-6和TNF-α含量均升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），說明電項針療法能促進下丘腦內免疫細胞因子的合成和分泌，增加睡眠時間，恢復睡眠結構，調節睡眠-覺醒周期。本實驗還發現2 Hz低頻刺激對細胞因子的的改善情況要優于50 Hz和100 Hz組，差異具有統計學意義（P＜0.05），這說明在治療失眠病時，低頻疏波刺激可以獲得更好的治療效果，促進睡眠時相的恢復。總之，2 Hz低頻電項針的促眠作用最好，其促眠作用的機制可能與調節下丘腦內免疫細胞因子IL-1β、IL-6和 TNF-α 含量有關。

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（本文編輯 匡靜之）

Experimental Study of the Influence of Electro-nape-acupuncture on the Hypothalamic Immunogical Cytokines in Insomnia Rats

WU Jianli1,DU Dongmei2,SHI Wenqiang3,WANG Tianqi2,YU Jie2,WANG Yongliang3,MEI Rongjun3*
(1. Institute of Acupuncture,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Haerbin,Heilongjiang 150040,China;2.Graduate College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Haerbin,Heilongjiang 150040,China;3.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Haerbin,Heilongjiang 150001,China)

Objective To observe the influence of different frequency electro-nape-acupuncture on the hypothalamic immunogical cytokines interleukin-1β (IL-1β),interleukin-6 (IL-6)and tumor necrosis factor-α （TNF-α）contents in rats with sleep deprivation，clear the function of electro-nape-acupuncture treatment for insomnia and discuss the possible mechanism of promoting sleep.Methods Fifty healthy male Wistar rats were randomly divided into normal group,model group,2 Hz stimulation group,50 Hz stimulation group,100 Hz stimulation group,10 rats in each group.The models of insomnia were established by using para-chlorophenylalanine (PCPA).After duplicating the models successfully, the rats of each different frequency treatment group weregiven electro-nape-acupuncturestimulation foroneweek,onetime/day,30 min/time.The normal and model groups were fixed in the corresponding time every day without any disposal.The rats in each group were sacrificed and the hypothalami were taken after treatment.The contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α in hypothalamus were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)in each group.Results Hypothalamic IL-1β,IL-6 and TNF-αcontents in the model group were significantly lower than those in the normal group(P＜0.05).Compared with the model group,the IL-1β,IL-6 and TNF-α contents increased significantly in each different frequency treatment group （P ＜0.05）.The hypothalamic IL-1β,IL-6 and TNF-α contents in 2 Hz stimulation group were higher than those in the 50 Hz and 100 Hz groups (P＜0.05)and there were no statistically significant differences between the 50 Hz and 100 Hz groups (P＞0.05).Conclusion Different frequency electro-nape-acupuncture all could effectively cure insomnia and the effect of 2 Hz group in promoting sleep is the best.The mechanism of promoting sleep may be related to regulating hypothalamic IL-1β,IL-6 and TNF-α contents.

sleep deprivation； electro-nape-acupuncture； immunogical cytokines； PCPA

R245.9+7

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2017.06.027

本文引用：吳建麗，杜冬梅，史文強，王天琪，于 杰，王永亮，梅榮軍.基于電項針對失眠大鼠下丘腦免疫細胞因子影響的實驗研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017,37（6）：679-683.

2016-11-08

哈爾濱市科技局科技創新人才研究專項資金項目（2015RAQXJ093）。

吳建麗，女，碩士研究生，助理研究員，研究方向：針灸治療睡眠障礙性疾病研究。

* 梅榮軍，男，碩士研究生導師，教授，E-mail：593925878@qq.com。