雙參口服液的研制及其抗氧化作用的研究①

馬麗文，宋琳琳，胡曉艷，胡曉冬，駱宇鑫，張 潔

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

雙參口服液的研制及其抗氧化作用的研究①

馬麗文，宋琳琳，胡曉艷，胡曉冬，駱宇鑫，張 潔

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討研制雙參口服液的最佳制備工藝及多糖含量測(cè)定，并研究多糖體外抗氧化性。方法：用正交試驗(yàn)法進(jìn)行制備工藝的研究，并對(duì)雙參口服液的多糖進(jìn)行含量測(cè)定以及體外抗氧化性的研究。結(jié)果： 雙參口服液研制的最佳超聲提取工藝為：樣品比例為2:1:2(玉竹:沙參:黨參)，超聲時(shí)間為50min，超聲溫度為60℃時(shí)，多糖的提取率最高。用苯酚-濃硫酸法測(cè)定樣品多糖的平均含量為15.90%。在體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中，雙參口服液中的多糖在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基和·OH自由基有清除能力。結(jié)論：雙參口服液中的多糖采用超聲波提取法是可行的并且含量較高，雙參口服液中的多糖具有很好的體外抗氧化活性。

雙參口服液；多糖；超聲提取；抗氧化活性

雙參口服液是由玉竹、沙參、黨參配伍而成，玉竹為百合科黃精屬植物玉竹(Polygonatum odoratum(Mill)Druce)的干燥根莖，該植物含有各種豐富的甾體皂苷[1]、多糖、氨基酸等化學(xué)成分，是一種生理活性顯著且極具開發(fā)利用價(jià)值的植物資源。多糖在玉竹中含量較高，玉竹多糖具有抗氧化[2]、強(qiáng)心、降血脂、降血糖等作用。黨參(Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.)為多年生草本植物，屬桔梗科，藥用干燥根。黨參主要成分為多糖、黃酮以及生物堿等成分。黨參多糖化合物在黨參中具有很強(qiáng)的生物活性，黨參多糖能起到降低血壓、降低血糖血脂、抗衰老[3]、抗腫瘤[4]等多種作用。沙參(Adenophora stricta Miq)多年生草本植物，屬桔梗科。北沙參的化學(xué)成分主要包括多糖、香豆素類、三萜酸、氨基酸等成分。沙參多糖具有祛痰作用、抗真菌作用、強(qiáng)心作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明自由基與許多疾病的發(fā)生、惡化以及有機(jī)體的衰老過程密切相關(guān)。本研究以玉竹、黨參、沙參為原料，對(duì)它們的活性多糖成分進(jìn)行超聲提取[5～7]，在此基礎(chǔ)上研發(fā)出雙參口服液，該產(chǎn)品的研發(fā)對(duì)促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材來源

玉竹、沙參、黨參等藥材購于黑龍江省佳木斯市藥店。

1.2 材料

儀器：KDM電加熱套(山東省甄誠環(huán)宇科研儀器廠)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(西安匯鴻環(huán)保科技有限公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TJ82-3電動(dòng)離心沉淀機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；FA2004電子分析天平(徐州彭宇電子儀器有限公司)；UV-757紫外可見分光光度計(jì)(北京譜析通用)；試劑：化學(xué)試劑均為分析純；無水乙醇(北京化工廠)；濃硫酸(北京化工廠)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；水楊酸(廣州溫聯(lián)化工有限公司)；DPPH(北京豪爾科技有限公司)。

2 方法

2.1 雙參口服液的研制

為優(yōu)化提取工藝條件，制定正交實(shí)驗(yàn)方案，本實(shí)驗(yàn)采取三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以確定最佳工藝條件，選用因素及水平見表1。按照所選取的比例稱取三種藥材共90g，將藥材浸泡12h后，進(jìn)行超聲提取，過濾，共提取2次，將2次濾液合并，濾液移至500mL燒杯中，將其濃縮到原來體積的1/3，冷卻，加入200mL 95%的乙醇溶液，邊加邊攪拌，然后靜置12h，之后將上層濾液倒入回收瓶里以備回收。將下層沉淀中殘余的乙醇揮發(fā)掉，然后將沉淀放在烘箱中105℃烘干。精密稱量干燥的樣品。多糖提取率(%)=多糖PoPs(mg)/樣品質(zhì)量(mg)×100%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)影響因素水平表

2.2 雙參口服液多糖的含量測(cè)定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取無水葡萄糖10mg，加蒸餾水溶解后并定容至100mL容量瓶中，搖勻，即配制得0.1mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的樣品10mg，加水溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分別放置于10mL干燥的具塞試管中，加入蒸餾水至2.0mL，搖勻。再分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5mL濃硫酸，搖勻，微振5min。放置5min后，置于沸水浴中加熱15min，然后取出，冷卻至室溫(25℃)。另外取一只10mL的具塞試管，以蒸餾水2.0mL按如上同樣操作后作為空白對(duì)照，于最大吸收波長(zhǎng)處(490nm)測(cè)定吸光度。同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。以葡萄糖濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 雙參口服液中多糖含量的測(cè)定

精密稱取各批次供試品液2.0mL，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下的自“加5%苯酚溶液”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中多糖的濃度。

多糖的含量(%)=(C樣×100/10000)×100% (C樣為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品濃度)

2.3 雙參口服液多糖的體外抗氧化性研究

2.3.1 對(duì)·OH自由基清除作用

[8],取1.0mL 0.15mol·mL-1pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，1.0mL 40μg·mL-1番紅花紅溶液，0.945mmol·mL-1EDTA-Fe(Ⅱ)(新配)溶液1.0mL，0.5mL不同濃度的雙參口服液多糖溶液、3%H2O2溶液1.0mL(新配)，在37℃水浴中加熱30min后在520nm處測(cè)定吸光度A樣。空白組以0.5mL水代替樣品測(cè)定吸光度A0。對(duì)照組以1.5mL蒸餾水代替H2O2和樣品測(cè)定吸光度A，用3.5mL蒸餾水代替番紅花紅、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、樣品，并和1.0mL磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行調(diào)零。清除率%=(A樣-A0)/(A-A0)×100%。

2.3.2 對(duì)DPPH·的清除能力

樣品與抗氧化劑預(yù)期作用模式為AH+DPPH·→DPPH-H+A，準(zhǔn)確稱取10mgDPPH，用50%乙醇定容至250mL容量瓶中，配得0.1mmol/L的DPPH溶液。見表2。

表2 DPPH·實(shí)驗(yàn)加樣表

樣品對(duì)DPPH·自由基的清除能力(scavenging activity，SA)可表示公式為

SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%

3 結(jié)果

3.1 雙參口服液的最佳制備工藝

見表3。

表3 雙參口服液正交實(shí)驗(yàn)提取結(jié)果

對(duì)上表進(jìn)行直觀分析可知，極差大小顯示各因素的影響作用依次為A>C>B，即樣品之間的比例>超聲溫度>超聲時(shí)間。雙參口服液研制的最佳超聲提取工藝為A3B3C2，即最佳提取工藝為樣品比例2:1:2，超聲溫度為60℃，超聲時(shí)間為50min。

3.2 雙參口服液多糖的含量測(cè)定

3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

在490nm處測(cè)定吸光度A值。橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度(C)，縱坐標(biāo)為吸光度(A)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線方程為y=0.0102x+0.088，R2=0.9932。

3.2.2 雙參口服液中多糖的含量測(cè)定

見表4。

表4 雙參口服液多糖的含量測(cè)定 (n=9)

經(jīng)計(jì)算，求得供試品中多糖的平均含量為15.9%。

3.3 雙參口服液的體外抗氧化性研究

3.3.1 對(duì)·OH自由基清除作用

取不同濃度的雙參口服液中的多糖溶液測(cè)定其多糖對(duì)·OH的清除作用。見圖2。

圖2 雙參口服液對(duì)·OH的清除能力

由圖2所知，不同濃度的雙參口服液中的多糖對(duì)·OH具有一定的清除作用，其清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，即雙參口服液中多糖濃度越大，對(duì)羥自由基的清除率越大。樣品在5～17.5mg·mL-1時(shí)，雙參口服液中的多糖清除羥自由基能力迅速提高，當(dāng)樣品濃度達(dá)到17.5mg·mL-1以后，清除羥自由基能力上升緩慢。各個(gè)樣品在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。

圖3 雙參口服液對(duì)DPPH·的清除能力

3.3.2 對(duì)DPPH·的清除能力

取不同濃度的雙參口服液中的多糖溶液測(cè)定其多糖對(duì)DPPH·的清除作用。不同濃度的雙參口服液多糖提取物樣品清除DPPH自由基的能力，見圖3。當(dāng)樣品達(dá)到一定濃度時(shí)所有樣品的DPPH自由基清除能力均提高迅速，之后增長(zhǎng)趨勢(shì)趨于緩慢，它們的DPPH自由基清除能力呈劑量依賴性，隨著濃度的逐漸增加其自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。

4 討論

雙參口服液是由玉竹、沙參、黨參配伍而成，采用超聲等工藝提取，配制而成的中藥復(fù)方制劑口服液，具有降血壓、降血脂之功效，為了使產(chǎn)品的質(zhì)量得以保證，本論文采用正交實(shí)驗(yàn)法，系統(tǒng)地考察了樣品之間的比例、超聲溫度、以及超聲時(shí)間對(duì)口服液多糖提取率的影響，并用苯酚硫酸法測(cè)定多糖的含量，摸索出制備工藝的最佳條件為樣品比例為2:1:2(玉竹:沙參:黨參)，超聲時(shí)間為50min，超聲溫度為60℃時(shí)，多糖的提取率最高。雙參口服液提取物多糖對(duì)清除·OH自由基、DPPH·自由基均有一定的量效關(guān)系，而且雙參口服液多糖在一定濃度范圍內(nèi)清除·OH、DPPH·自由基效果隨雙參口服液提取物多糖濃度的增加而加強(qiáng)。

綜上所述，雙參口服液多糖的提取采用超聲波提取法，工藝合理，含量較高，并且雙參口服液提取物多糖對(duì)清除·OH自由基、DPPH·自由基均有一定的量效關(guān)系，將作為一種抗氧化新藥為人類的健康作出貢獻(xiàn)。

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1.國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：21271089；2.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：201510222036；3.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：13Z1201561。

馬麗文(1995～)女，黑龍江哈爾濱人，在讀本科生。

宋琳琳(1982～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail：linlin19822891@163.com。

R285.5

A

1008-0104(2017)03-0001-03

2016-12-10)