JNK通路參與Aβ1-40誘導的海馬神經干細胞凋亡過程①

王國輝，王麗華，秦麗紅，王 璇，高鳳榮，王昆祥

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

JNK通路參與Aβ1-40誘導的海馬神經干細胞凋亡過程①

王國輝，王麗華，秦麗紅，王 璇，高鳳榮，王昆祥

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討在Aβ1-40誘導的海馬神經干細胞凋亡過程中JNK通路的作用。方法：應用Westernblot技術檢測Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h對海馬神經干細胞JNK磷酸化水平的影響；在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入JNK阻斷劑SP600125(10μM)共同孵育12h、24h和48h，應用Hoehest33342染色和MTT法檢測SP600125與Aβ1-40聯合作用后對神經干細胞凋亡的影響。結果：在不同時間點，JNK磷酸化水平均增加，24h表達最顯著(P<0.01)；給予SP600125后可使Aβ1-40誘導的神經干細胞死亡明顯減輕。結論：Aβ1-40激活JNK通路后促進了海馬神經干細胞凋亡。

Aβ1-40；JNK；凋亡

c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)超家族的成員之一。JNK通路常存在于多種生命過程中，如細胞分化和細胞死亡等[1]，是一條與細胞凋亡相關的重要信號轉導途徑。有文獻報道，JNK通路可被多種凋亡刺激因素所激活，而且當JNK活性降低或JNK通路被抑制時，可在一定程度上對神經細胞的死亡起到保護作用[2]。而大量研究證實，阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是由β-淀粉樣多肽(Aβ)聚集誘導神經細胞損傷甚至凋亡所致[3,4]。因此，對JNK通路的研究有助于為揭示AD的發病機制提供依據。本實驗以Aβ1-40和SP600125為施加因素，觀察JNK通路在Aβ1-40誘導的神經干細胞凋亡中的作用，為探究AD的發病機制提供理論及實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(<72h)，雌雄均可，購于佳木斯大學實驗動物中心。

1.2 主要實驗藥品

Aβ1-40購于Biosouxee公司，MTT、Hoechst33342、TEA購于Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1Westernblot技術

將細胞經裂解液處理后提取蛋白樣品，取50μg蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后進行轉膜，轉膜結束后封閉1h，一抗孵育并4℃過夜，TBS-T溶液洗膜后孵育二抗1h，TBS-T溶液洗膜后進行ECL顯影，掃片及數據處理分析。

1.3.2MTT法

在神經干細胞中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，置37℃培養4h，吸去培養液后加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10min，酶標儀OD570nm處檢測各孔吸光值。

1.3.3Hoechst33342法

在細胞中加入4%多聚甲醛，與培養液以1：3混合，固定細胞10min。去除固定液，在各組細胞中加入Hoechst33342，37℃孵育15min。吸除染色液并洗滌后，直接在熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1Aβ1-40慢性孵育對海馬神經干細胞JNK磷酸化水平的影響

Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h后，應用Westernblot技術檢測Aβ1-40對海馬神經干細胞中JNK的影響。結果顯示，在不同時間點，JNK磷酸化水平均增加，24h表達最顯著(n=3，P<0.05)。見圖1。

圖1 Aβ1-40慢性孵育對海馬神經干細胞JNK磷酸化水平的影響

*P<0.05

2.2SP600125與Aβ1-40聯合作用對海馬神經干細胞凋亡的影響

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM)，與Aβ1-40共同孵育12h、24h和48h，應用MTT法觀察其對海馬神經干細胞存活率的影響。結果顯示，SP600125可明顯減輕Aβ1-40誘導的神經干細胞死亡，使細胞存活率明顯升高(P<0.01)。見圖2。

圖2 SP600125與Aβ1-40聯合作用對海馬神經干細胞存活率的影響

(與對照組相比#P<0.01；與Aβ1-40組相比*P<0.01)

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM)，與Aβ1-40共同孵育48h，應用Hoehest33342染色觀察其對海馬神經干細胞凋亡發生率的影響。結果顯示，SP600125可明顯降低Aβ1-40所引起的細胞凋亡發生率，由(18.2±1.7)%降至(8.1±06)%(P<0.01)。

3 討論

AD是一種與衰老相關并以記憶和認知功能障礙為主要特征的退行性腦病，其主要病理特征為新皮層、海馬等處出現Aβ沉積形成的高度老年斑、神經纖維纏結和大量神經元的減少等[5]。其中，Aβ沉積形成老年斑進而導致神經細胞損傷甚至凋亡是AD發病的核心因素，因此，探究Aβ導致神經細胞凋亡的過程是非常有必要的，它可為明確Aβ的毒性作用機制提供依據。近年來有大量相關文獻報導，JNK通路是一條與神經細胞凋亡相關的常見信號轉導通路[6,7]，因此，可以做進一步研究以明確JNK通路是否參與了Aβ導致的神經細胞凋亡過程，這對于揭示AD的發病機制有重要意義。本實驗以Aβ1-40和SP600125為施加因素，觀察了SP600125在Aβ1-40所

誘導的海馬神經干細胞凋亡中的作用，結果顯示，Aβ1-40可增加JNK磷酸化水平的蛋白表達；給予SP600125后可使Aβ1-40誘導的神經干細胞死亡明顯減輕。這些結果表明，JNK通路的激活參與了Aβ1-40誘導的海馬神經干細胞凋亡過程，即，Aβ1-40激活JNK通路后引起了海馬神經干細胞的凋亡。在前期工作中發現延遲整流鉀通道也參與了Aβ1-40誘導的海馬神經干細胞凋亡過程，那么，JNK通路與延遲整流鉀通道在Aβ1-40誘導的海馬神經干細胞凋亡過程是否存在一定的聯系呢？在今后的實驗中可進一步研究，以更加明確Aβ1-40誘導的細胞凋亡過程的機制。

[1]IpYT,DavisRJ.Signaltransductionbythec-JunN-terminalkinase(JNK)-frominflammationtodevelopment[J].CurrOpinCellBiol, 1998, 10:205-219

[2]CarolMTroy,SylviaARabacchi,ZhihengXu,etal.β-Amyloid-inducedneuronalapoptosisrequiresc-JunN-terminalkinaseactivation[J].J-Neurochem, 2001, 77(1):157-164

[3]田嘉瑩，盛寶英，齊志國.β1-40致傷的神經干細胞的存活率及Caspase-3的活性變化[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(1)：111-112

[4]張金波，王淑秋，張虎，等.靈芝孢子粉對戊四氮活化海馬神經細胞bcl-2表達的研究[J].黑龍江醫藥科學，2012，35(4)：34-35

[5]VillafloresOB,ChenYJ,ChenCP,etal.Curcuminoidsandresveratrolasanti-Alzheimeragents[J].Taiwanesejournalofobstetrics&gynecology, 2012,51(4):515-525

[6]DonnaBozyczko-Coyne,TeresaMO’Kane,Zhi-LiangWu,etal.CEP-1347/KT- 7515,aninhibitorofSAPK/JNKpathwayactivation,promotessurvivalandblocksmultipleeventsassociatedwithAβ-inducedcorticalneuronapoptosis[J].JournalofNeurochemistry, 2001, 77:849-863

[7]欒倩，劉蕾，劉君星，等.靈芝酸對癇樣放電海馬神經元ERK1/2磷酸化水平的影響[J].黑龍江醫藥科學，2014，37(2)：1-3

黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12521569。

王國輝(1971～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫師。

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1008-0104(2017)03-0008-02

2017-03-18)