細胞外基質磷酸糖蛋白對體外細胞生物學行為的影響①

李善昌，董 波，曲學延，閆 磊，寧尚波，劉占領

(佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳術斯 154002)

細胞外基質磷酸糖蛋白對體外細胞生物學行為的影響①

李善昌，董 波，曲學延，閆 磊，寧尚波，劉占領

(佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳術斯 154002)

目的：探討細胞外基質磷酸糖蛋白對體外細胞生物學行為的增殖影響及基因表達。方法:構建含細胞外基質磷酸糖蛋白基因的質粒后穩定轉染細胞株，利用RT-PCR檢測轉染后細胞株hMEPE蛋白表達結果。基于蛋白表達結果基礎上通過RT-PCR檢測p53基因的表達水平，MTT實驗檢測細胞增殖水平。結果：RT-PCR結果顯示與轉染空載體細胞相比p53基因在轉染目的基因細胞表達增高。MTT結果有統計學意義(P<0.05),顯示轉染后的hmepe細胞株較轉染空載體細胞相比增殖能力明顯提高。結論：細胞外基質磷酸糖蛋可以通過p53信號通路提高細胞增殖能力。

細胞外基質磷酸糖蛋白;增殖

細胞外基質磷酸糖蛋白(matrixextracellularphosphoglycoprotein,MEPE)最早是2000年由RowePS等人最早在腫瘤源性骨軟化癥(tumorinducedosteomalacia，TIO) 的腫瘤中提取得到的，并且將其命名為MEPE，隨后學者們將其定位為人的第4號染色體(4q21.1)，目前公認MEPE是腫瘤細胞分泌的磷酸蛋白因子[1]。MEPE蛋白作為小型N端連接整合素家族蛋白 (smallintegrin-bindingligandN-linkedGlycoproteins,SBLING)的一員，其C端有一段酸性富含絲氨酸-天冬氨酸MEPE相關基序(acidicserine-aspartate-richMEPE-associatedmoti,fASARMmotif)[2，3]。

近10年來的實驗結果可分析出SIBLINGs家族成員通過此序列與細胞表面整合素的結合來介導細胞黏附及信號傳導[4]，參與基質的鈣化，骨質、牙齒的形成，與細胞增殖能力有密切關系。不管是上皮來源還是間充質來源的腫瘤當中均能發現較高水平的SIBLING家族蛋白的表達。目前大量的研究發現，他們可參與腫瘤發展的許多階段，包括腫瘤細胞的初期的黏附增殖、以及局部侵襲和后期細胞外基質的降解、腫瘤性血管的發生、逃避宿主免疫、腫瘤的遠處轉移(尤其是骨轉移)、以及各種腫瘤組織病理性鈣化的形成[5]。本實驗通過相關檢測研究MEPE蛋白對腫瘤細胞增殖的生物學行為的影響，以及其基因信號通路的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株、質粒MEPEcDNA及質粒pLEGEP-N(購于BDBiosciencesClontech公司)；293T細胞株(中科院上海細胞研究所)；大腸桿菌E.coliDH5T(本實驗室提供)。PBS(1X)(吉諾生物醫藥技術有限公司)；DMEM高糖培養基(Sigma公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；PBS(Hclone公司)；RNAisoPlus(寶生物工程有限公司);LipofectamineTM2000;G-418Sulfate(GIBCO)。QIAprep質粒提取試劑盒(Qiagen公司)；PCR產物純化Geneclean11試劑盒(Cat# 1001-400)(BIO101公司)；T4DNA連接酶(購自Takara生物公司)。

1.2 方法

1.2.1PCR擴增、表達質粒的構建及序列測定

擴增MEPEcDNA全長，其擴增引物:上游引物:5′一CATATGAAGCTGAATGAAGAT- 3；下游引物: 3′-GGATCCTTACATTTGGGGGAGATG- 3′，PCR擴增的目的基因經NdeI與BamHI雙酶切后，將pLEGEP-N1載體進行同樣酶切處理，隨后將前者克隆到后者得到融合質粒表達，通過感受態大腸桿菌DH5T挑去單克隆進行篩選，選出一個或兩個陽性克隆進行PCR測序，并進行序列及讀碼框架結果正確與否的鑒定。

1.2.2 穩定轉染細胞株構建

細胞生長狀態優良且融合率達 90%以上時進行轉染。按照說明手冊將細胞轉染至6孔板加入胰酶消化48h后制備細胞懸液，稀釋細胞懸疑至原有懸液的10倍，將其鋪于96孔板內，每孔分別加入600ug/mLG418完全培養基進行克隆篩選，常規培養4周后克隆陽性細胞進行鑒定并擴增培養凍存。

1.2.3RT-PCR檢測

按照已購買的RNA提取試劑的操作說明書 ,用Trizol提取細胞總RNA。實驗之前所用器具用DEPC水浸泡過夜,去除RNA酶。RT-PCR檢測轉染細胞中p53基因的表達。p53引物上游:TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG,下游ATGTGCTGTGACTGC-TTGTAGATG。

1.2.4MTT檢測增殖能力

293T細胞生長密度至80%時常規胰酶消化、計數 ,接種2000～3000個細胞至96孔板中，目的基因組、空載體組 ,每組 3個復孔。置于培養箱中培養。細胞培養至 2、4、6及 8d后 ,加入20μLMTT(濃度為5mg/mL)繼續培養4h，終止培養，小心吸盡培養基。每孔加入150μLDMSO，室溫下振蕩10min，在酶標儀上設定波長490nm測定并記錄各孔吸光度值。

圖1pLEGFP一N1-mepe轉染細胞及pLEGFP一N1轉染細胞RT-PCR電泳圖

a：DL5OODNAmarker:b、c：空載體細胞及轉染目的基因的GAPDH表達;d轉染MEPE質粒細胞中MEPE表達;e轉染EGFP細胞中MEPE表達。

2 結果

2.1 穩定轉染細胞株的檢測

穩定轉染細胞株后提取轉染細胞總RNA進行PCR檢測，電泳圖結果顯示兩組細胞90bp附近均有GAPDH擴增條帶出現;目的基因細胞轉染后擴增條帶出現在120bp;空載體組在120bp處無擴增條帶出現，證明轉染成功，見圖1。

2.2RT-PCR檢測相關因子表達情況

從產物電泳圖比較三種基因在兩種細胞中的不同表達,見圖2。

2.3MTT檢測細胞增殖結果

MTT檢測結果顯示轉染MEPE的293T細胞其增殖數量增加近1.3倍，見表1。

圖2 轉染MEPE及空載體細胞中基因表達

a.DL500DNAmarker;b. 轉染MEPE細胞中GAPDH表達 ;c.轉染空載體細胞中GAPDH表達;d.DL500DNAmarker;e. 轉染空載體細胞中p53 表達 ;f. 轉染MEPE細胞中p53表達。

表1 MTT法檢測MEPE及EGFP空載體轉染293T 細胞增殖指數

注：P<0.05

3 討論

鑒于SIBLINGs家族成員在正常生理情況下與成骨細胞、破骨細胞發揮功能密切相關，大量研究人員推測它與腫瘤骨轉移也必然有著千絲萬縷的聯系。近幾十年來的報道顯示腫瘤發展的許多階段包括腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、血管生成都與SIBLINGs家族蛋白密切相關。KaluU.E等人報道某些SIBLING家族成員蛋白以及其相關的基質金屬蛋白酶(MMPs)在腫瘤細胞表達水平提高，并且與腫瘤的不同發展階段密切相關。目前已知的三種蛋白包括BSP,OPN和DMP1，與MMPs有很高的親和力，很容易形成SIBLING-MMPs復合體從而行使多種功能，例如腫瘤的侵襲和轉移[6]。CuiR等[7]研究顯示如果刻意阻斷OPN與血管發生的關鍵因子整合素受體αvβ3相互作用時，可見大鼠體內的肺癌細胞生長緩慢甚至停滯。SharpJA等[8]人研究發現注射轉染中的IBSP基因到裸鼠體內可使其體內乳腺癌MDA-MB231細胞增殖水平提高，顯示骨唾液蛋白(BSP)能夠加劇腫瘤發生。通過對以上體內外的實驗結果分析,我們可以證實SIBLING家族成員蛋白對腫瘤細胞有較大的影響,本實驗通過檢測結果證明MEPE蛋白表達水平的對細胞增殖的生物學特性的影響,且PCR電泳圖結果證實其作用機制是通過p53蛋白信號通路實現的。臨床上腫瘤具有增殖失控，侵襲，轉移等共性，這些特點是治療腫瘤致命的要點，MEPE的研究成果為探索癌的發生機制，早期診斷及預后判斷標志提供了多方面的線索，大大提高了對癌癥早期發現幾率，抓住治療時機，為惡性腫瘤的基因治療奠定了基礎。雖然目前基因治療尚未在臨床普及,但大量研究顯示此種療法具有優良的應用前景。此外對于MEPE對腫瘤細胞的其他生物學行為的影響及分子機制的研究還不完善，有待進一步體外實驗的探索。

[1]RowePS,DeZoysaPA,DongR,etal.MEPE,anewgeneexpressedinbonemarrowandtumorscausingosteomalacia[J].Genomics,2000,67(1):54-68

[2]BellahceneA,CastronovoV,OgburekeKE,etal.Smallintegrin-bindingN-linkedGlycoproteins(SIBILINGs):multifunctionalproteinincancer[J].NatRevCancer, 2011, 8(3):212-226

[3]FisherLW,FedarkoNS.SixgenesexpressedinbonesandteethencodethecurrentmembersoftheSIBLINGfamilyofproteins[J].ConnectTissueRes, 2009, 44(1): 33-40

[4]GVKulkarni,BChen,JPMalone,etal.PromotionofselectivecellattachmentbytheRGDsequenceindentinematrixprotein1[J].ArchOralBiol,2000，45(6)：475-484

[5]SharpJA,WalthamM,WilliamsED,etal.TrensfectionofMDA-MB-231humanbreastcarcinomacellswithBonesialoprotein(BSP)stimulatesmigrationandinvasioninvitroAndgrowthofprimaryandsecondarytymorsinnudemice[J].ClinExpMetastasis，2004，21：19-29

[6]KUOgburekeandLWFisher.ExpressionofSIBLINGsandtherPartnerMMPsinsalivaryglands[J].JDentRes,2004，664-670

[7]GuiR.Abrogationoftheinteractionbeteeenosteopontinandαvβ3integrinreducestumorgrowthofhumanlungcancercellinmice[J].LungCancer，2007，57:302-310

[8]ZhiyongMi,HongtaoGuoandPaulCKuo.Identificationofosteopontin-dependentsignalingpathwaysinamousemodelofhumanbreastcancer[J] .BMCResearchNotes, 2009, 2: 119-12

黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12521553。

李善昌(1969～ )男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。

Q25;Q

A

1008-0104(2017)03-0010-02

2017-03-05)