白藜蘆醇對衰老的人臍靜脈內皮細胞小窩蛋白-1表達的影響①

衣慧婷，張 麗，郭 麗

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

白藜蘆醇對衰老的人臍靜脈內皮細胞小窩蛋白-1表達的影響①

衣慧婷，張 麗，郭 麗

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察小窩蛋白-1(Cav-1)在白藜蘆醇(Res)作用于衰老的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中的變化。方法：體外培養HUVECs，通過傳代形成細胞的衰老模型，以衰老相關β-半乳糖苷酶活性、細胞增殖能力和p53、p21蛋白為衰老標志物進行觀察。通過不同濃度Res作用衰老的HUVECs后，SA-β-gal法檢測β-半乳糖苷酶活性、流式細胞術檢測細胞周期來反映細胞增殖能力，Westernblot蛋白印跡法檢測p53、p21和Cav-1蛋白表達。結果：與衰老組相比，隨著Res作用濃度的增加，各用藥組藍染細胞逐漸減少(P<0.05)，但與青年組相比，藍染細胞增多(P<0.01)；與衰老組比較，Res不同濃度組G0/G1期細胞比例均降低(P<0.01)，S期細胞比例均明顯增多(P<0.01)，但與青年組相比，G0/G1期細胞比例增高(P<0.01)；與衰老組比較，Res不同濃度組p53、p21和Cav-1表達均降低，且呈Res濃度依賴性。結論：Res可以延緩HUVECs衰老，其分子機制可能與下調衰老細胞Cav-1表達有關。

白藜蘆醇；細胞衰老；內皮細胞功能障礙；小窩蛋白-1

內皮細胞衰老引起的內皮細胞功能減退是心腦血管疾病隨年齡增加的主要因素之一[1,2]，衰老的血管內皮細胞增殖、遷移及舒張能力減弱，導致血管內皮功能障礙。血管內皮功能障礙一直以來都被認為是高血壓、動脈粥樣硬化、血栓等心腦血管疾病發生發展中的關鍵環節。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)，是一種天然多酚類植物抗毒素，主要存在于葡萄中，亦存在于花生，藍莓中，因“法國悖論”而聞名世界。研究發現，白藜蘆醇在抗腫瘤、抗氧化、保護心血管、抗衰老、抗菌、保護神經系統、抗糖尿病、抗炎等方面都具有積極的作用[3]。張麗等[4]研究發現，Res有抗動脈粥樣硬化的作用，其機制與抑制小窩蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)的mRNA和蛋白表達，上調eNOS表達，促進NO的釋放有關。通常意義上的血管內皮功能障礙，指的是各種原因引起的血管內皮細胞NO的生物利用度減弱或者NO的合成不足所導致的內皮依賴性舒張功能的減弱。因此，衰老的血管內皮細胞中可能也存在相似的機制。本研究通過在體外建立人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)衰老模型，以探討Res在衰老的血管內皮細胞中的效應和作用機制，為尋找抗內皮細胞凋亡和保護內皮細胞功能藥物的臨床和科研領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)購自Gibco公司，DMEM培養基、胰酶購自Hyclone公司，衰老相關β-半乳糖苷酶(Senescenceassociated-β-Galactosidase,SA-β-gal)染色試劑盒購自碧云天公司，碘化丙啶(PI)購自Sigma公司，兔抗Cav-1抗體、鼠抗p21抗體、鼠抗p53抗體、鼠抗Actin抗體購自SantaCluz公司。

1.2HUVECs分離培養和細胞衰老鑒定

原代細胞分離自出生后12h內的新生兒臍帶(由佳木斯大學附屬第一醫院產科提供)。取孕婦剖腹產術后新鮮臍帶約15cm，PBS沖洗干凈。采用胰蛋白酶(0.25%)消化處理方法分離血管內皮細胞[5]。HUVECs用含有20%胎牛血清的DMEM培養基培養，培養條件為5%CO2、溫度為37℃，傳代并計算細胞群體倍增水平(Populationdoubings，PDLs)[6]，PDL=Log(N2/N1)，N2為終末細胞數，N1為初始細胞數，PDL會隨代數而增加。SA-β-Gal活性是細胞衰老的標志物。根據染色情況，將PDL≤8HUVECs定義為青年細胞，PDL≥44HUVECs定義為衰老細胞[7]。

1.3SA-β-Gal檢測細胞衰老情況

根據細胞衰老特異性SA-β-Gal檢測試劑盒操作方法，棄去原細胞培養板里的培養液后，按500μL/孔加入清理液，再棄去清理液，按500μL/孔加入固定液，室溫下孵育5min后吸去固定液，按500μL/孔加入酸性液，并重復一次。最后，按400μL/孔加入染色工作液，放入37℃培養箱中培養12h后，在倒置顯微鏡下觀察和計數。

1.4 流式細胞術分析細胞周期變化情況

細胞以2×105/孔接種于6孔板，24h后待細胞貼壁，進行藥物處理。指定時間后，消化收集經藥物處理過細胞，加入冰冷的PBS緩沖液并將細胞吹打成單細胞懸液。800rpm/min離心5min，PBS洗兩遍，逐滴加入1mL冰冷的70%乙醇，4℃固定過夜。染色前PBS洗兩遍后重懸于500μL的PBS中，加入RNaseA，37℃孵育30min。常溫避光染色1h，流式細胞儀測定碘化丙啶熒光強度，CELLQuestPro分

析細胞周期變化。

1.5Westernblot檢測衰老相關蛋白

收集經藥物處理后的細胞，用冰冷的PBS洗2次，加入預冷的含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30min，4℃、12000g離心15min，測定蛋白濃度，加入3×上樣緩沖液煮5min，然后SDS-PAGE電泳、封閉、轉膜、一抗和二抗孵育，曝光。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1HUVECs培養及衰老鑒定

原代HUVECs按照群體倍增水平方法傳代(Populationdoublings，PDL)方法傳代，倒置顯微鏡下可觀察到PDL8HUVECs呈現短梭狀或鋪路石樣緊密排列，而PDL44HUVECs失去鋪路石樣緊密排列特征，細胞體積增大，形態不一，可見胞漿中有較多的顆粒或空泡。為進一步鑒定PDL44HUVECs是否呈現衰老狀態，我們分別對PDL8和PDL44HUVECs進行SA-β-gal染色、流式細胞術檢測細胞周期及細胞周期相關基因檢測。結果發現，PDL44HUVECs藍染細胞比例相比PDL8HUVECs增加了7倍(P﹤0.01)(圖1，A)；PDL44HUVECs細胞周期發生G1期阻滯(圖1，B)；PDL44HUVECs細胞中細胞周期蛋白p53和p21的表達水平相比PDL8HUVECs分別上調64.3%(P=0.02)和40.8%(P=0.01)，PDL44HUVECs細胞中Cav-1的表達水平上調34.6%(P=0.02)(圖1，C)。以上現象均提示PDL44HUVECs呈衰老狀態。

圖1 衰老HUVECs的鑒定

注：A.PDL8HUVECs(a)及PDL44HUVECs(b)SA-β-gal染色B. 流式細胞術分析PDL8HUVECs(a) 及PDL44HUVECs(b) 細胞周期C.Westernblot檢測PDL8HUVECs(1) 及PDL44HUVECs(2)p53、p21和CAV-1蛋白的表達

2.2Res對衰老的HUVECsβ-半乳糖苷酶活性的影響

不同濃度Res(0.01μM、0.1μM、1μM)作用于HUVECs96h，利用SA-β-Gal染色試劑盒可以檢測HUVECs在Res作用下細胞衰老的情況，SA-β-Gal染色呈藍色為陽性衰老細胞。研究發現，與衰老組相比，隨著Res作用濃度的增加，各用藥組藍染細胞逐漸減少(P<0.05)，但與青年組相比，藍染細胞增多(P<0.01)。

圖2 不同濃度Res對衰老的HUVECs SA-β-Gal活性的影響

注：*P<0.05，#P<0.01

2.3Res對衰老的HUVECs細胞周期的影響

不同濃度Res(0.01μM、0.1μM、1μM)作用于HUVECs24h，與衰老組比較，各濃度組G0/G1期細胞比例均降低(P<0.01)，S期細胞比例均明顯增多(P<0.01)。但與青年組相比，G0/G1期細胞比例增高(P<0.01)。

圖3 流式細胞術檢測不同濃度Res對衰老的HUVECs細胞周期的影響

圖4Westernblot檢測不同濃度Res對衰老的HUVECsp53、p21和Cav-1蛋白表達的影響

2.4Res對衰老的HUVECsp53、p21和Cav-1表達的影響

不同濃度Res(0.01μM、0.1μM、1μM)作用于HUVECs96h，Westernblot檢測p53、p21和Cav-1蛋白的表達。與衰老組比較，各濃度組p53、p21和Cav-1表達均降低，且呈Res濃度依賴性。

3 討論

目前，世界各國正逐漸步入人口老齡化社會。隨著年齡的增長，心血管病的發病率明顯升高，血管老化是心血管病發病率隨年齡增長而升高的重要環節。血管老化的病理變化主要為血管內皮細胞衰老及由其引起的血管內皮細胞功能障礙。血管內皮除了具備物理屏障功能，還可調節血管新生與重構、參與炎癥反應、調節凝血與纖溶反應以及調節血管舒縮能力等。其中，NO為血管內皮細胞合成和分泌的主要的血管舒張松弛因子，主要由eNOS以L-精氨酸為底物，在四氫生物蝶呤(BH4)的輔助下合成的，主要的生理功能為舒張血管、清除氧自由基[8]、抑制小板聚集等[9]。當在病理條件或者衰老的情況下，血管內皮細胞NO的生物利用度減弱或者NO的合成不足，引起內皮依賴性舒張功能減弱，導致血管內皮功能障礙。因此，提高NO的水平可以延緩內皮細胞衰老進程。Cav-1是膜整合蛋白，參與膽固醇平衡、分子運輸和跨膜信號發放事件。目前，誘發細胞老化的刺激信號途徑主要為：p56-p21途徑和p16-Rb途徑，Cav-1可通過p56-p21途徑阻滯細胞周期進程，發揮負性調控細胞增殖的作用，參與細胞衰老。在心血管事件中，Cav-1還能充當eNOS基因的抑制劑，它從胞膜的分離與細胞老化和心力衰竭有關，這個過程能夠導致eNOS活性的下降[10]。前期研究表明，Res抗動脈粥樣硬化的作用機制與抑制Cav-1表達，上調eNOS表達，促進NO的釋放有關。細胞的衰老是心血管事件的獨立危險因素，是導致內皮功能障礙的主要因素之一，而血管內皮功能障礙貫穿高血壓、動脈粥樣硬化始終，反過來它們也能加重內皮損害，造成惡性循環。由此可見，血管內皮細胞衰老及其功能障礙在也血管病的發生發展過程中起著十分重要作用。因此深入了解血管內皮細胞衰老及其功能障礙的產生機制具有重要的意義。我們通過進一步研究發現，Res能夠降低衰老的血管內皮細胞Cav-1表達，促進細胞增殖，從而能夠延緩細胞衰老，為合理有效的干預心血管疾病提供理論依據。

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1.黑龍江省自然科學基金資助，編號：D201210；2.黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12541781。

衣慧婷(1985～)女，遼寧丹東人，在讀碩士研究生。

張麗(1973～)女，黑龍江鶴崗人，碩士，副教授，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail:heyealice@163.com。

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