黃芩苷固體脂質納米粒的藥代動力學和體外對肝癌細胞生長研究①

曹越盛，郭英雪，于 蓮，周 實，平 洋

(1.佳木斯市中心醫院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

黃芩苷固體脂質納米粒的藥代動力學和體外對肝癌細胞生長研究①

曹越盛1，郭英雪2，于 蓮2，周 實2，平 洋2

(1.佳木斯市中心醫院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：采用高效液相色譜法研究黃芩苷固體脂質納米粒在大鼠體內的藥物動力學特征，觀察黃芩苷固體脂質納米粒在體外對肝癌細胞生長影響。 方法：采用大鼠尾靜脈注射給藥，測定不同時間點大鼠體內的血藥濃度。采用CCK-8法測定黃芩苷固體脂質納米粒溶液體外抑制Hep G-2細胞的生長情況。結果：黃芩苷固體脂質納米粒溶液和黃芩苷溶液組在大鼠體內均符合藥動學二室模型(權重系數為1/C2)，且黃芩苷固體脂質納米粒溶液組平均AUC0-t=350.751μg/mL，t1/2=5.983h，baicalin溶液組AUC=231.178μg/mL，t1/2beta=4.434h，黃芩苷固體脂質納米粒溶液在體內的絕對生物利用度為163.394%。結論：黃芩苷固體脂質納米粒溶液在大鼠體內具有緩釋作用，且黃芩苷固體脂質納米粒溶液體外對Hep G-2細胞的生長有抑制作用，并且抑制作用強于黃芩苷溶液組。

黃芩苷固體脂質納米粒；藥代動力學；體外抗腫瘤

黃芩苷(baicalin, C21H18O11)是從唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。具有多種藥理作用，如降壓、鎮靜、保肝、利膽、抗菌、消炎等，臨床證明其抗菌抗炎作用確切，主要用于感染性肝炎、肺炎等疾病[1～5]。由于黃芩苷的親水性和親油性較差，經口服給藥后，藥物在腸道的吸收不完全，導致其生物利用度差，進而限制了黃芩苷在臨床上的應用。因此通過改變劑型增加體內的吸收并提高生物利用度。目前國內外許多從事藥物研發的工作者對黃芩苷的藥理、藥效等作用研究已經十分深入，已發現黃芩苷具有抗菌抗病毒、清除氧自由基、抗氧化、解熱、鎮痛、抗炎、抗腫瘤、保護心腦血管及神經元、保肝、預防或治療糖尿病及其并發癥等作用[6～9]，肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，病程隱匿，病死率高，容易產生耐藥[10～13]，使肝癌治療很不理想，導致治療失敗和預后不佳。本研究將繼續對黃芩苷固體脂質納米粒(BSLNs)的體內藥動學進行研究，并考察BSLNs體外抑制肝癌細胞作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀工作站(日本島津公司)；TGL-16M高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)；FA2004N-電子分析天(上海恒平科技有限公司)；XW-80A旋渦混合器(鄭州南北儀器設備有限公司)；371型-CO2培養箱(美國Thermo公司)TECAN sunrise光吸收酶標儀(瑞士帝肯公司)。

1.2 試藥

黃芩苷原料藥(諸城市浩天藥業有限公司，含量85%)；黃芩苷標準品(天津一方科技有限公司，含量98%，批號10081418)；卡馬西平標準品(中國藥品生物制品檢定所，含量99.7%，批號10014-201004)；黃芩苷固體脂質納米粒(自制)；黃芩苷原料藥(諸城市浩天藥業有限公司，含量85%)； CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)；RPMI-1640培養基(Hyclone)；胎牛血清(Hyclone)；PS(Hyclone)；0.25%胰酶(Hyclone)；PBS(Hyclone)其他溶劑或試劑均為色譜純級別。

1.3 動物及細胞

SD大鼠(大連醫科大學動物實驗中心，SCXK(遼)2008-0002)，體重(200±20)g；Hep G-2人肝癌細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)。

2 實驗方法

色譜條件: Agilent C18色譜柱(4.6mm ×250mm，5 μm)； 流動相：甲醇-水-磷酸(55:45:0.2)；流速：1mL·min-1；紫外檢測波長279nm；柱溫：室溫； 進樣量：10μL；內標：卡馬西平。

對照品溶液和內標溶液配制: 精密稱取黃芩苷對照品10mg，置于100mL容量瓶中，甲醇定容，配制成濃度為100μg/mL的黃芩苷對照品溶液。分別精密吸取不同濃度的標準品溶液置于10mL容量瓶中，甲醇定容，得到濃度分別為3～50μg/mL系列濃度的對照品溶液。

精密稱取內標物卡馬西平10mg，甲醇溶液定容于100mL容量瓶中，配成濃度為100μg/mL的卡馬西平溶液。精密吸取1mL于100mL容量瓶中，配制濃度為10μg/mL卡馬西平甲醇溶液備用。

動物分組及給藥方案: SD大鼠8只隨機分成兩組，即黃芩苷溶液組和黃芩苷固體脂質納米粒溶液組，大鼠禁食12h后尾靜脈注射給藥，劑量為大鼠體重30mg/kg，分別于給藥后0.25、0.5、1、2、2.5、4、5、6、8、12h眼眶取血2mL于肝素鈉抗凝管中，14000r/min

離心10min分離血漿，-18℃凍存。

血漿樣品處理及測定: 取大鼠血漿0.5mL，分別加入內標物50μL、乙腈0.5mL，渦旋1min，14000r/min離心10min，取上清液水浴揮干(55-60℃)。殘渣用300μL流動相溶解，進樣10μL，記錄色譜圖及峰面積。

方法專屬性考察: 分別吸取2份空白血漿樣品0.5mL，一份按“血漿樣品處理”項操作，HPLC測定并記錄色譜圖；另一份空白血漿樣品中加入黃芩苷標準品50μL和內標物卡馬西平50μL，處理方法同上，HPLC測定并記錄色譜圖；再取給藥后血漿樣品0.5mL，處理方法同上，HPLC測定并記錄色譜圖。

標準曲線繪制: 精密吸取若干份空白血漿，每份0.5mL，分別加入50μL濃度為3～50μg/mL的黃芩苷甲醇標準品溶液，配制成含不同濃度黃芩苷的血漿樣品溶液，按“血漿樣品處理”項操作，HPLC測定，以樣品中黃芩苷的濃度為橫坐標，黃芩苷標準品與內標物的峰面積比值為縱坐標，繪制血漿樣品中黃芩苷標準曲線。

精密度考察: 取9份空白血漿，每份0.5mL，分別加入5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL黃芩苷標準品溶液0.1mL，渦旋混合1min，配制成3個不同濃度的血漿樣品，每個濃度3份，按“血漿樣品處理”項進行操作，每隔10min HPLC測定，代入黃芩苷血漿標準曲線，計算日內精密度。

回收率試驗: 取3份大鼠空白血漿0.5mL，分別加入高、中、低黃芩苷標準品溶液0.1mL，渦旋混合1min，按“血漿樣品處理”項進行操作，HPLC測定，記錄黃芩苷與內標物的峰面積，計算峰面積比值，并代入血漿標準方程中算濃度，以測得濃度與實際加入濃度的比計算方法回收率。

HepG-2細胞的培養: HepG-2細胞培養于RPMI-1640培養基中，內含90%RPMI-1640培養基，10%胎牛血清，1%PS。放于5%CO2培養箱中進行培養傳代。

CCK-8實驗方法: 取對數生長期HepG-2細胞按1×105/mL，接種于96孔板內，每個濃度設定3個復孔，放于5%CO2培養箱中正常培養，向每孔中加入不同濃度的baicalin溶液和BSLNs溶液，對照組加等量培養液，繼續培養12、24、48h后每孔加入 CCK-8 溶液放于5%CO2培養箱培養，酶標儀450nm測定各孔的吸光度值，并計算各組對HepG-2細胞生長抑制率。

2 結果

2.1 方法專屬性考察

在選定的色譜條件下，黃芩苷出峰時間為7.5min，內標物出峰時間為10.8min，黃芩苷與內標物分離較好，在樣品處理過程中未引入干擾性雜質，因此在此色譜條件下，黃芩苷測定無干擾。見圖1～3。

圖1 空白血漿

圖2 空白血漿加標準品和內標

圖3 血漿樣品

圖4 HPLC法測定血樣中黃芩苷標準曲線

血漿樣品中黃芩苷的標準曲線方程為y=0.0066x-0.0215, R=0.9972，在線性范圍為3～50μg/mL，線性關系良好，見圖4。

2.2. 方法學考察

見表1～3。

表1 血漿樣品中測得黃芩苷精密度

日內精密度相對標準偏差小于15%，日內精密度高，符合體內藥物分析要求。

表2 血漿樣品中測得黃芩苷回收率

表2說明黃芩苷在血漿中的方法回收率達到體內藥物分析要求。藥物濃度-時間曲線和藥動學參數大鼠體內血漿藥物濃度-時間曲線見圖5。將BSLNs樣品溶液組和baicalin溶液組的血藥濃度結果用“藥動學計算程序3P97”擬合，求動力學參數，見表3。

圖5 大鼠尾靜脈注射黃芩苷溶液和黃芩苷固體脂質納米粒注射液后藥-時曲線(n=3)

表3 大鼠尾靜脈注射后動力學參數

圖5可知BSLNs樣品溶液組的藥-時曲線下面積大于baicalin溶液組藥-時曲線下面積，說明BSLNs在大鼠體內吸收效果好于baicalin溶液。由表3中數據可知BSLNs和baicalin溶液在體內藥動模型均符合二室模型，權重系數為1/C2 ；BSLNs在體內的消除半衰期t1/2beta=5.983h，baicalin溶液的消除半衰期t1/2beta=4.434h，說明BSLNs樣品溶液在大鼠體內的停留時間長于baicalin溶液，說明BSLNs具有緩釋作用；BSLNs樣品溶液組AUC=350.751，baicalin溶液組AUC=231.178，說明BSLNs在體內的吸收作用強于baicalin溶液；BSLNs樣品溶液組在體內清除率CL=0.171，baicalin溶液組CL=0.260，相比baicalin溶液組 BSLNs樣品溶液組在體內的清除率降低，再次說明BSLNs緩釋作用效果明顯。

2.3 生物利用度

絕對生物利用度，說明固體脂質納米粒這種劑型提高了黃芩苷在體內生物利用度。

2.4 CCK-8法體外抑制Hep G-2細胞生長

見圖6～8。

圖6 12h HepG-2細胞體外抑制率

圖7 24h HepG-2細胞體外抑制率

圖8 48h HepG-2細胞體外抑制率

由圖6～8可以看出baicalin組對HepG-2細胞生長的抑制率隨著時間的延長抑制率逐漸減弱， 24h后僅42μg/mL和37.5μg/mL兩個濃度對HepG-2細胞生長有抑制作用，且抑制率不足20%，其余濃度均對HepG-2細胞沒有抑制作用。BSLNs組對HepG-2細胞生長的抑制率明顯高于baicalin組，有效濃度在16.7～42μg/mL，且高濃度范圍33.3～42μg/mL BSLNs組對HepG-2細胞生長的抑制作用隨著時間的延長，24h時抑制率最高，可以達到76.7%；中濃度范圍16.7～25μg/mL BSLNs組對HepG-2細胞生長的抑制率隨著時間的延長呈上升趨勢，且在48h抑制率為72.4%。說明BSLNs組對抑制HepG-2細胞的生長情況優于baicalin組。BSLNs較baicalin抑制HepG-2細胞生長作用強。

3 討論

本實驗對BSLNs進行了體內藥動學和體外抗肝癌細胞活性研究，采用反相高效液相色譜法測定血漿樣品中黃芩苷藥物濃度，結果BSLNs樣品溶液在大鼠體內吸收效果高于baicalin溶液；血藥濃度-時間數據擬合結果可知BSLNs樣品溶液和baicalin溶液在大鼠體內均符合藥動學二室模型，且BSLNs樣品溶液組平均AUC0-t和t1/2均高于baicalin溶液組，說明BSLNs在體內的吸收利用度較baicalin溶液組好，并且在體內具有明顯的緩釋作用，BSLNs在體內的絕對生物利用度為163.394%。CCK-8法體外抑制HepG-2細胞試驗結果表明，BSLNs樣品溶液組的體外抑制癌細胞生長作用效果明顯高于baicalin溶液，這既符合黃芩苷的藥理作用，也說明固體脂質納米粒這種劑型能夠保證黃芩苷最大作用發揮療效，當然也為將來BSLNs對體內抗腫瘤作用研究提供理論基礎。

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Study of pharmacokinetic and anti liver cancer cells effect of baicalin solid lipid nanoparticles in vitro

CAOYue-sheng1,GUOYing-xue2,YULian2,ZHOUShi2,PINGYang2

(1.Department of Pharmacy, Central Hospital of Jiamusi City, Jiamusi 154002,China;2.College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To investigate the pharmacokinetics of baicalin solid lipid nanoparticals (BSLNs) in rats by HPLC method, and the inhibitory effect of BSLNs on the Hep G-2 cells. Method: By intravenous administration, the concentration of baicalin in blood plasma at different time points were determined. Human Hep G-2 cells were treated with BSLNs, and the effects on cells inhibition were investigated by CCK-8 cell viability assay. Result: The study of pharmacokinetics of BSLNs and baicalins-sol in rats showed that the two preparations were fitted with two-compartment model; and pharmacokinetic results showed that the mean AUC0-t of BSLNs group was 350.751μg/mL, t1/2is 5.983h, while the AUC=231.178μg/mL, t1/2beta=4.434h. (Weighting factor is1/C2). The absolute bioavailability was 163.394%. Conclusion: BSLNs group shows a significant sustained-release in vivo. Then BSLNs shows a greater effect on inhibiting the growth of Hep G-2 cells compared with baicalins-sol group.

baicalin solid lipid nanoparticals;pharmacokinetics;anti-tumor in vitro

佳木斯大學校級科研項目，編號：S2014-016。

曹越盛(1985～)男，黑龍江佳木斯人，學士，藥師。

平洋(1986～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail：18245482328@163.com。

R285.5；R735.7

A

1008-0104(2017)03-0053-04

2016-12-20)