慢性牙周炎基礎治療前后齦溝液中MMP-3和TIMP-2水平的變化①

朱建華,賈會敏,劉繼光,李佳薇,苗藝繽

(佳木斯大學附屬第二醫院， 黑龍江 佳木斯 154002)

慢性牙周炎基礎治療前后齦溝液中MMP-3和TIMP-2水平的變化①

朱建華,賈會敏,劉繼光,李佳薇,苗藝繽

(佳木斯大學附屬第二醫院， 黑龍江 佳木斯 154002)

目的：探討根據檢測慢性牙周炎基礎治療前后GCF中MMP-3的水平以及TIMP-2的水平和MMP-3/TIMP-2的比值。方法：選取15例經臨床確診的慢性牙周炎患者口腔內20顆重度牙周病的患牙的齦溝液(GCF)樣本，同時選取15例健康對照組患者口腔內的20個牙位的GCF樣本，采用ELISA實驗法檢測患牙齦溝液中MMP-3和TIMP-2的含量，MMP-3/TIMP-2比值。在開始治療前采集被選患者的GCF，同時也要對臨床相關的指標詳細探查，并在系統治療完成后以1個月時間為標準重復取樣。結果：牙周基礎治療結束后MMP-3和TIMP-2的總量與治療前相比顯著下降(P<0.05),治療前后MMP-3與TIMP-2的總量與對照組相比有顯著差別(P<0.05),治療結束后MMP-3與TIMP-2的比值與治療前相比顯著下降，并高于正常對照組MMP-3與TIMP-2的比值。MMP-3的含量與TIMP-2的含量呈顯著正相關(P<0.01)。結論:慢性牙周病患者GCF中MMP-3和TIMP-2的水平以及MMP-3與TIMP-2的比值可用作監測慢性牙周炎病情的敏感指標。

慢性牙周炎；齦下刮治術；根面平整術；齦溝液；MMP-3；TIMP-2；ELISA

口腔病變對人類健康造成的危害已得到充分證實，其中一種疾病是在人類口腔中最常見的牙周病，近年來該疾病由于在全球范圍內不斷上升的發病率而引起更多學者的深入研究。此前，牙周病變被認為是引起牙周組織缺損以及造成牙齒缺失的確定性病因，因此，對牙周病的致病因素，進展以及臨床治療的探究發揮十分重要的意義。在牙周病不斷進展的過程中，特別是一些炎性因子逐漸的對牙周組織進行破壞和分解，而MMPs及其抑制因子(TIMPs)作為能導致牙周病發生的蛋白水解酶起著重要作用。研究表明，在機體正常狀況下，MMPs與TIMPs二者間維持著動態均衡的關系，兩者間的動態均衡維護了牙周組織的生理結構和正常的功能。而在某些刺激因子的作用下，MMPs與TIMPs的比重超出正常范圍引起MMPs的過多分泌，促使細胞外基質降解增多，因此在牙周病中二者之間的平衡關系被打破，表現在牙周方面的破壞成為造成牙周病發生的原因之一[1]。齦溝液檢測樣本的收集簡單快捷方便，患者易于接受，適用人群范圍很廣。本課題通過測定齦溝液中MMP-3和TIMP-2的水平，研究二者之間的水平以及它們之間的平衡與慢性牙周炎的關系，通過檢測MMP-3和TIMP-2的水平來監控病情，分析療效，二者含量的失衡有可能參與慢性牙周炎的病情發展，并將MMP-3與TIMP-2的比值作為新的因素進行比較分析。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源：選取2016-01～2016-03來本醫院牙周黏膜病科就診并確診的慢性牙周病患者(根據1999年美國牙周病學會的分類標準)。納入標準：(1)無任何全身系統性疾病；(2)至少在6個月之內不曾使用抗生素或至少在3個月之內未使用過非淄體類抗炎藥；(3)1年之內無任何牙周病治療史。排除標準：妊娠或者哺乳期的婦女；(2)吸煙的患者；(3)口腔內的余留牙不足20顆；(4)有過正畸治療史。從完全適合以上標準的患者的口腔內選擇1～2顆重度的牙周病患牙(牙周袋深度在6mm以上，附著喪失在5mm以上，牙槽骨在X線片上面顯示吸收程度在根長的1/2以上甚至接近根長的2/3)為試驗牙，從15位患者口腔中選擇20顆試驗牙，選中男9例，女6例，年齡20～60歲。

1.1.2 齦溝液樣本的采集：本研究采取濾紙條稱重法采集齦溝液，將濾紙條放入符合標準的受試牙牙周袋內采集齦溝液，30s后取出，間隔2min在相同受試牙位置重復采集齦溝液，將樣本置于1.5mLEppendorf管中，立即稱重并記錄結果，隨后將收集的樣本存放于-20℃的冰箱中直到樣本收集完畢檢測MMP-3和TIMP-2的含量。

1.2 主要儀器和試劑

MMP-3ELISA試劑盒,TIMP-2ELISA試劑盒, 酶標儀,MMP-3酶標板,TIMP-2酶標板, 低溫冰箱, 高速離心機。

1.3 方法

依據ELISA試驗方法檢測齦溝液中的MMP-3和TIMP-2。按照ELISA的試劑說明書進行操作，將全部收集到存放于冰箱內的樣本取出放于室溫下一次性解凍，加入約250μLPBS緩沖液(pH=7.4)，使用振蕩器恒溫震蕩1h，之后使用400r的高速離心機以10000r/min的速率離心10min，以去除多余的雜質。取上清液分別裝入之前準備好的兩只干凈離心管內，用MMP-3和TIMP-2試劑盒測定MMP-3和TIMP-2的含量。

1.4 統計學方法

2 結果

牙周基礎治療前后與正常對照組間齦溝液的量均有顯著差異(P<0.05)。牙周基礎治療完成后MMP-3，TIMP-2的總量與治療前相比顯著降低(P<0.05)，治療前后MMP-3，TIMP-2的總量與正常對照組MMP-3，TIMP-2的總量對比有顯著差異(P<0.05)。

牙周基礎治療結束后MMP-3與TIMP-2的比值與治療前對比下降(P<0.05)，治療結束后MMP-3與TIMP-2的比值高于正常對照組MMP-3與TIMP-2的比值(P<0.05)。MMP-3與TIMP-2在GCF中的含量呈顯著正相關(P<0.01),見表1～3。

表1 牙周基礎治療前后與正常對照組間齦溝液量的對比

表2 牙周基礎治療前后與正常對照組之間齦溝液量的對比±s,n=20,ng/μL)

表3 牙周基礎治療前后以及正常對照組MMP-3和TIMP-2的含量

3 討論

牙周病是由于炎癥因子的刺激而以破壞牙周組織為主的慢性進行性變病，在牙周組織逐漸受損的過程中，MMPs發揮非常重要的作用[2]。近年來很多研究采取收集患牙的齦溝液來探討慢性牙周炎與MMPs水平之間的關系，在正常的情況下，有大量的菌斑微生物存在于齦溝內，齦溝內的滲透梯度處于不斷的變化中，故齦溝內會存在少量的齦溝液，當牙周組織由于刺激而發生炎癥時，齦溝以及結締組織發生水腫，同時齦溝液的總量會明顯增加[3]。而本實驗表明：牙周基礎治療前后齦溝液的量與正常對照組齦溝液的量均有顯著差異(P<0.05)。而MMP-3是一種基質溶解素，可以激活不同類型的MMPs，使它們由最初的酶原形式逐漸轉變為具有活性的MMPs，從而導致牙周骨質的降解和改建，對于加重牙周組織炎癥起到很關鍵的作用[4，5]。MMPs能降解細胞外基質，同時參與人體內結締組織的降解，重建，一些炎癥反應等生理病理過程[6]。然而TIMPs在體內對MMPs起到一定的抑制作用[7]，目前TIMPs家族包括4種：TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4，它們在體液和組織內分布非常廣泛，TIMPs能夠結合MMPs的催化部位，對MMPs降解ECM進行抑制，MMPs和TIMPs在體內維持著ECM降解和分泌的平衡[8]。有研究報道，有不同種類的基因對MMPs，TIMPs的表達進行調控，而TIMPs的表達同樣受到MMPs的影響，從而構成十分錯綜復雜的網絡系統，在機體組織發生炎癥時，MMPs的表達與TIMPs的表達相比呈增高的趨勢，因此，這種情況導致破壞，降解機體的炎癥組織。同時，在牙周組織發生重度的炎癥時，組織中會存在許多炎性細胞，包括單核細胞，巨噬細胞等能夠生成TIMPs，而當牙周組織的炎癥得到有效的控制后，隨之組織中的炎性細胞會相對減少，產生TIMPs的量同時也會對應減少[9，10]。在人體正常組織中MMPs與TIMPs的合成與降解存在一定的比例關系，當人體組織由于某種刺激而發生炎癥反應時，會導致MMPs的分泌增多，造成ECM和基底膜發生降解，同時其抑制因子TIMPs的含量會相應升高對機體起到保護的作用。本研究結果顯示：牙周基礎治療結束后，MMP-3，TIMP-2的總量與治療前對比明顯降低，治療前后MMP-3，TIMP-2的總量與正常對照組MMP-3，TIMP-2的總量對比有明顯差異。同時，本研究表明：牙周基礎治療完成后，MMP-3和TIMP-2的比值與治療前對比明顯降低，治療結束后MMP-3與TIMP-2的比值高于正常對照組MMP-3與TIMP-2的比值。而本實驗也證實：在系統的牙周基礎治療完成后，MMP-3和TIMP-2的含量與治療前對比顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.01)。

本研究通過檢測慢性牙周炎患者牙周基礎治療前后GCF中MMP-3和TIMP-2的含量以及MMP-3與TIMP-2的比值與正常對照組進行對比，本實驗結果表明慢性牙周病患者牙周基礎治療前后GCF中MMP-3，TIMP-2的含量以及MMP-3與TIMP-2的比值有顯著差異(P<0.05)。因此，本實驗說明MMP-3與TIMP-2的比值可以用來客觀評價牙周組織的健康狀況和疾病狀態，牙周病變的治療效果以及監控慢性牙周病的病情發展。

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[9]TevrhaialaT,PirilaE,CeponisA,etal.TheinvivoexPerssionofhtecollagen一olytiematrixmetalloPorteinases(MMP-2,-8,-13,nad-14)nadmatrilysin(MM-7)inadultnadloealizedjuvenilePeriodontitis[J].JDentRes,2000,79(12):1969

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Changes of MMP-3 and TIMP-2 levels in gingival crevicular fluid before and after treatment in patients with chronic periodontitis

ZHUJian-hua,JIAHui-min,LIUJi-guang,LIJia-wei,MIAOYi-bin

(The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Objective: To explore the basis through the detection of chronic periodontitis before and after treatment in gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase factor -3 (MMP-3) and the level of matrix metalloproteinase inhibitor -2 (TIMP-2) and the ratio of MMP-3/TIMP-2. Methods: GCF selected 15 teeth with clinically diagnosed patients with chronic periodontitis oral 30 severe tooth the week's disease (GCF) samples, and 15 cases of healthy control group GCF samples of 30 teeth in the oral cavity of the patient who suffered from MMP-3 and TIMP-2, were detected in gingival crevicular fluid by ELISA assay, The ratio of MMP-3/TIMP-2. The GCF was collected and the clinical examination should be at the end of treatment and 4 weeks after treatment. Results: after basic periodontal treatment and treatment of total MMP-3 and TIMP-2 decreased significantly than before (P<0.05),andtheamountofTIMP-2MMP-3beforeandaftertreatmentcomparedwiththecontrolgroupweresignificantlydifferent(P<0.05),treatmentaftertreatmentwithTIMP-2andMMP-3ratiothanbeforesignificantlydecreased,andhigherthanthatinthenormalcontrolgroupandMMP-3.MMP-3ratioofTIMP-2andthecontentofTIMP-2wassignificantly.Conclusion: MMP-3 and TIMP-2 levels in patients with chronic periodontitis (P<0.01)andtheratioofMMP-3toTIMP-2maybeusedasasensitiveindexformonitoringtheconditionofchronicperiodontitis(GCF).

chronic periodontitis；subgingival scaling and root planing；gingival crevicular fluid；MMP-3；TIMP-2；ELISA

佳木斯大學科技創新項目，編號：YM2016 078。

朱建華(1959～)女，黑龍江佳木斯人，學士，教授，碩士研究生導師。

劉繼光(1961～)男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導師。E-mail:13633645349@163.com。

R

B

1008-0104(2017)03-0065-03

2016-11-12)