載阿霉素的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)對C6細胞的毒性研究①

王公釗，劉君星，辛 華，王振玉，劉春輝，喬 峰，王 琳

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

載阿霉素的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)對C6細胞的毒性研究①

王公釗1，劉君星2，辛 華1，王振玉1，劉春輝1，喬 峰1，王 琳1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究載DOX(阿霉素)的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)(NPS)對C6細胞(大鼠膠質(zhì)瘤細胞)的毒性作用。方法：通過乳化/溶劑蒸發(fā)法制備NPS-DOX和Tf-NPS-DOX，用MTT法檢測NPS-DOX和Tf-NPS-DOX對體外培養(yǎng)的C6細胞的毒性作用，并以NPS、Tf-NPS、DOX作為對照組。結(jié)果：24h時，藥物濃度為0.1μg/mL時，Tf-DOX-NPS的作用比較明顯，存活率為78.90%，而NPS-DOX組為93.77%，DOX組為95.54%；隨著藥物濃度的增高及時間的延長，48hNPS-DOX體現(xiàn)了更好的殺傷作用，4μg/mL作用48h時存活率僅為19.34%，而DOX的存活率為34.98%，Tf-DOX-NPS存活率為26.36%。結(jié)論：載DOX(阿霉素)的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)比單純抗癌藥對C6細胞的毒性作用更強。

納米載藥系統(tǒng)；阿霉素；靶向；C6細胞

阿霉素(Doxorubicin)是一種應(yīng)用廣泛的化療藥物，已經(jīng)被美國食品藥品管理局認證為最有效的癌癥化療藥物之一，但其較低水溶性及低選擇性限制了它的臨床應(yīng)用，患者用藥后骨髓抑制和心臟毒性呈現(xiàn)劑量依賴[1]。在過去的十幾年中，對共聚物納米粒做為運載化療藥物工具的研究日益增加，納米載藥系統(tǒng)憑借其獨特的藥物靶向策略和藥物釋放機制改善了藥物遞送過程中穩(wěn)定性低、溶解度小、選擇性差等問題，顯著增強了藥物的抗腫瘤作用[2，3]。在本實驗中，我們選擇了具有良好生物相容性的兩親性納米聚合物γ-PGA-co-PLA-DPPE(γ-多聚谷氨酸-聚乳酸-二棕櫚酰磷酯酰乙醇胺)作為載體，通過乳化/溶劑蒸發(fā)法包載阿霉素，并在載體上引入轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)靶向基，最后以C6細胞為模型，比較納米藥物和游離藥物在相同劑量時對腫瘤細胞生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀(RS-232-C，美國BIO-RAD公司)，倒置式生物顯微鏡(CKX41，Olympus)，二氧化碳培養(yǎng)箱(E191IR/W200IR，美國西蒙公司)。C6細胞購買于ATCC細胞庫，MTS試劑(CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay)購買于Promega公司。所有其他試劑和溶劑均為分析級。

1.2 方法

1.2.1 載藥納米粒子的制備

納米載體由國家納米中心提供，載有阿霉素的納米粒子是通過乳化/溶劑蒸發(fā)法制備[4]。以Tf-NPS-DOX為例，將20mg納米共聚物溶于2mL二氯甲烷(DCM)構(gòu)成共聚物溶液，1mg的DOX溶解在1mLDCM中。取400μLDOX溶液滴加到2mL共聚物溶液中，并加入1%的PVA。磁力攪拌10min后，在40w功率下超聲5min，所得乳狀液減壓蒸餾除去溶液中的二氯甲烷。旋蒸后的乳狀液在13000rpm下離心20min得靶向載藥納米粒子，去離子水洗滌三次除去殘留的PVA。將載藥納米粒子溶解在PBS(pH=7.4)溶液中，備用。

1.2.2MTT法檢測藥物對細胞的毒性作用

用MTT法測定NPS、Tf-NPS、NPS-DOX、Tf-NPS-DOX、DOX對體外培養(yǎng)的C6細胞的細胞毒性。體外培養(yǎng)C6細胞(培養(yǎng)基為DMEM，含10%胎牛血清，1.2%雙抗，培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度5%)，當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期時，用PBS沖洗細胞2遍，胰酶消化，細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)節(jié)濃度至 1×105/mL；將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種100μL(約1×104個細胞)，培養(yǎng)24h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μL含4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL的NPS、Tf-NPS、NPS-DOX、Tf-NPS-DOX、DOXDMEM培養(yǎng)基，另設(shè)空白組(不加藥)，每個濃度4個平行樣品，繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時間24h和48h；每孔加入20μLMTS試劑，37℃靜置1h。全自動酶標(biāo)儀于490nm波長檢測溶液吸光值，實驗重復(fù)3次。繪制不同藥物濃度下不同作用時間的細胞生長曲線。

2 結(jié)果

圖A、B顯示，從0.01～4μg/mL不同濃度的藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細胞存活率的變化?？梢园l(fā)現(xiàn)，NPS組在0.1μg/mL以下時沒有產(chǎn)生明顯的毒性，證明了共聚物納米粒子在0.1μg/mL以下具有良好的生物安全性。

NPS-DOX組、Tf-NPS-DOX組、DOX組，隨著藥物作用時間的增加以及阿霉素濃度的升高，細胞活力明顯降低。藥物作用24h時，Tf-NPS-DOX組在較低濃度(0.1μg/mL)時，率先顯示出比較好的抑制作用，細胞存活率為78.90%，這是由癌細胞表面高表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體高效的介導(dǎo)Tf-NPS-DOX入胞產(chǎn)生作用[5]；高濃度時，24h三組的毒性作用相差不大，而培養(yǎng)48h后，NPS-DOX組、Tf-NPS-DOX組毒性作用明顯優(yōu)于DOX組，可以歸因于阿霉素由NPS-DOX、Tf-NPS-DOX釋放緩慢。這是因為納米粒子進入細胞是采取主動轉(zhuǎn)運，但游離的DOX進入細胞是通過擴散，擴散通路的激活可以使游離DOX快速進入細胞，而裝載DOX的納米顆粒的藥物釋放需要酸性環(huán)境觸發(fā)，如酸性細胞器[4]。

圖A，圖B 分別為NPS、Tf-NPS、NPS-DOX、Tf-NPS-DOX、DOX作用于C6細胞24h、48h的細胞存活率-藥物濃度曲線

3 討論

化療藥物是治療腫瘤的主要方法之一，但化療藥會隨著血液循環(huán)到達全身絕大部分器官與組織，選擇性差；而且具有明顯的閾值，增加到一定量時具有明顯的毒副作用，呈現(xiàn)劑量依賴性[6]。納米載藥系統(tǒng)可以通過被動靶向(主要為EPR效應(yīng))和主動靶向(載藥納米顆粒表面腫瘤靶向配體修飾)克服這一缺陷，比如：RGD修飾的納米載藥系統(tǒng)，EricA.Murphy等人用RGD修飾載有阿霉素的納米粒子，并觀察到載藥納米粒子在整合素過量表達的腫瘤血管處富集并引起細胞的凋亡，相對于游離阿霉素，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力增強了15倍[7]。

在本實驗中，我們利用γ-PGA的親水性及PLA的疏水性片段，組成新型的兩親性納米粒子γ-PGA-co-PLA-DPPE，并在載體上結(jié)合了Tf以提高藥物的靶向性。實驗結(jié)果顯示，具有轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的藥物在較低濃度時率先顯示出較好的抑制作用,此與TfR的高效介導(dǎo)藥物入胞相關(guān)。在正常細胞中，TfR(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)表達水平較低，而快速生長的腫瘤細胞因為需鐵量增加，TfR表達顯著增加，可達正常細胞的10～100倍[8]，相比非靶向載藥納米粒子，腫瘤靶向修飾的載藥納米膠束能夠更有效地抑制腫瘤細胞的生長，更迅速地穿透細胞膜并更多的在細胞內(nèi)積累。此外通過對24h與48h結(jié)果對比，得出載藥納米顆粒具有緩釋特性，可以增加藥物在體內(nèi)的作用時間，降低用藥量。

綜上所述，我們評價了載DOX的γ-PGA-co-PLA-DPPE納米載藥系統(tǒng)對C6細胞的毒性作用，可為臨床用藥提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，希望能夠早日將更多的納米載藥系統(tǒng)推向臨床試驗。

[1]MohanP,RapoportN.Doxorubicinasamolecularnanotheranosticagent:effectofdoxorubicinencapsulationinmicellesornanoemulsionsontheultrasound-mediatedintracellulardeliveryandnucleartrafficking[J].MolecularPharmaceutics, 2010, 7(6):1959-1973

[2]李晶晶, 郭曼曼, 韓順平,等. 共修飾冰片和葉酸的阿霉素聚酰胺-胺納米給藥系統(tǒng)的制備及體外評價[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2015，(7):59

[3]陳熙, 張馨欣, 李菲菲,等. 載鹽酸伊立替康的半乳糖修飾脂質(zhì)-介孔硅核殼納米粒對肝癌細胞的抑制效果[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2014，(5):1156

[4]LiuX,SuS,WeiF,etal.ConstructionofnanoparticleSbasedonamphiphiliccopolymersofpoly(gamma-glutamicacidco-L-lactide)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineasapotentialdrugdeliverycarrier[J].JournalofColloid&InterfaceScience, 2014, 413:54-64

[5]李華, 胡世林, 王海龍,等. 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾共載阿霉素和Rg3脂質(zhì)體靶向抑制胃癌細胞增殖[J]. 中國生化藥物雜志, 2014, 34(1):1

[6]李明軍, 李英夫, 吳雁,等. 氰基丙烯酸正丁酯納米載體促進紫杉醇?？鼓X膠質(zhì)瘤作用的實驗研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2015, 38(2):29-30

[7]MurphyEA,MajetiBK,BarnesLA,etal.Nanoparticle-mediateddrugdeliverytotumorvasculaturesuppressesmetastasis[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 2008, 105(27):9343-9348

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佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項目，編號：LZR2015-013。

王公釗(1990～)男，山東泰安人，在讀碩士研究生。

王琳(1974～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:wanglin4477@163.com。

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