三種藥物相關基因多態性在黑龍江省東部地區糖尿病患者中的分布①

方 舟，方 芳，季方茹，李艷翠

(佳木斯大學附屬第一醫院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

三種藥物相關基因多態性在黑龍江省東部地區糖尿病患者中的分布①

方 舟，方 芳，季方茹，李艷翠

(佳木斯大學附屬第一醫院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：比較黑龍江佳木斯地區健康人群和2型糖尿病患者中藥物相關基因TCF7L2SNPrs12255372、IRS-1SNPrs2943650、MTHFRC677TSNPrs1801133基因多態性的分布，為糖尿病患者的診斷與個體化治療提供臨床依據。方法：應用熒光染色原位雜交法(Fish法)檢測佳木斯地區健康人群和2型糖尿病(T2DM)患者TCF7L2、IRS-1、MTHFRC677T的基因型。采用SPSS17.0軟件，計數資料采用χ2檢驗方法分析。結果：佳木斯地區健康人群和2型糖尿病患者TCF7L2、IRS-1的三種基因型頻率分布組間比較P>0.05，基因型分布無統計學意義；MTHFRC677T三種基因型頻率分布組間比較(P<0.05)，基因型分布有統計學意義。結論：黑龍江佳木斯地區健康人群MTHFRC677TSNPrs1801133位點基因多態性分布與2型糖尿病患者存在關聯；IRS-1SNPrs2943650、TCF7L2SNPrs12255372基因位點與2型糖尿病患者沒有相關性。

糖尿病，藥物相關基因，基因多態性，熒光原位雜交

1 儀器和試劑

熒光原位雜交DNA測序分析程序：北京華夏時代基因科技發展有限公司；TL-988實時熒光定量PCR儀：西安天隆科技儀器有限公司；掌式離心機：珠海博邁杰生物科技有限公司；HC-3017高速離心機：科大創新股份有限公司中佳分公司；PHARM-GENE200SNP分析樣品處理試劑，PHARM-GENE01SNP分析保存液(北京華夏時代基因科技

發展有限公司)。

2 方法

2.1 標本來源

選取2014-06～2016-06住院的2型糖尿病患者324例，體檢健康人270例，糖尿病排除1型糖尿病、妊娠型糖尿病和特殊類型糖尿病，診斷依據WHO1998年新的診斷標準。

2.2 基因檢測

2.2.1 基因多態性檢測方法

檢測條件：95℃預變性600s；95℃變性30s，62℃復性75s，45或50個循環。在樣品檢測的同時，加測3種不同基因型的質控品作為對照。

方法：取150μL新鮮全血加入含有1000μL氯化銨溶液的Eppendorf試管中，混合混勻后室溫放置5min，離心5min，加入100μL耀金保，震蕩混合混勻，室溫放置20～30min。吸取本液1.0～1.5μL加入待測基因對應的耀金分試劑中，漩渦混合均勻，瞬時離心，上至機器中檢測。

解析：分析已知反應物和產物,結合題意“調節pH≈3”可知缺項是 H+,Ce3+→Ce(OH)4,失1 e-,H2O2→Ce(OH)4,得2 e-,根據得失電子守恒,Ce3+前的化學計量數為2,H2O2前的化學計量數為1,再根據電荷守恒,H+前的化學計量數為6,最后觀察可知H2O2前的化學計量數為6,配平的方程式為2Ce3++H2O2+6H2O==2Ce(OH)4↓+6H+。

2.2.2 基因型的判斷

將檢測的樣品熒光曲線圖與質控品曲線圖進行比較。

TCF7L2SNPrs12255372熒光擬合曲線見圖1；IRS1SNPrs2943650熒光擬合曲線見圖2；MTHFRSNPrs1801133熒光擬合曲線見圖3。

2.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件χ2檢驗來計算糖尿病組和健康人組的三種基因型的分布頻率，P<0.05為差異具有顯著性。

圖1 TCF7L2 SNP rs12255372(G>T)熒光擬合曲線

圖2 IRS 1 SNP rs2943650(C>T)熒光擬合曲線

圖3 MTHFR SNP rs1801133(C>T)熒光擬合曲線

3 結果

3.1TCF7L2基因多態性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取健康人對照組270例，糖尿病患者324例，按上述方法測定TCF7L2SNPrs12255372基因型，結果：GG基因型155例，分布頻率為57.4%；GT型75例，頻率27.8%；TT型40例，頻率14.8%，其中G等位基因頻率為66.7%，T等位基因頻率為33.3%。糖尿病患者324例，TCF7L2SNPrs12255372基因GG型170例，頻率52.5%；GT型86例，頻率26.5%；TT型68例，頻率21.0%，其中G等位基因頻率為65.7%，T等位基因頻率為34.3%。健康人與糖尿病患者TCF7L2基因分布頻率見表1。

表1 健康人與糖尿病患者TCF7L2基因型分布頻率表

對照組與糖尿病組TCF7L2SNPrs12255372其等位基因概率經χ2檢驗，可知(χ2=0.104，P>0.05)，其等位基因分布頻率沒有顯著性差異，無統計學意義。三種基因型GG/GT/TT分布頻率，經χ2檢驗，可知(χ2=3.826，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統計學意義。

3.2IRS-1 基因多態性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取糖尿病患者324例，按上述方法測定IRS1SNPrs2943650基因型：測定結果：CC型6例，頻率1.9%；CT型36例，頻率11.1%；TT型282例，頻率87%，其中C等位基因頻率為48%，T等位基因頻率為92.2%。選取健康人對照組270例，測定結果：CC型9例，頻率3.3%；CT型36例，頻率13.3%；TT型225例，頻率83.3%，其中C等位基因頻率為10%，T等位基因頻率為90%。健康人與糖尿病患者IRS-1基因型分布頻率見表2。

表2 健康人與糖尿病患者IRS 1基因型分布頻率表

對照組與糖尿病患者IRS-1SNPrs2943650基因型頻率，其等位基因概率經χ2檢驗，可知(χ2=1.654，P>0.05)，其等位基因分布頻率無顯著性差異，不具有統計學意義。三種基因型CC/CT/TT頻率經χ2檢驗，可知(χ2=2.117，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統計學意義。

3.3MTHFR基因多態性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取健康人對照組270例，測定MTHFRSNPrs1801133基因，結果：CC型36例，頻率13.3%；CT型135例，頻率50%；TT型99例，頻率36.7%，其中C等位基因頻率為38.3%，T等位基因頻率為61.7%。測定糖尿病患者324例，MTHFRSNPrs1801133基因CC型70例，頻率21.6%；CT型119例，頻率36.7%；TT型135例，頻率41.7%，其中C等位基因頻率為40.0%，T等位基因頻率為60.0%。健康人與糖尿病患者MTHFR基因分布概率見表3。

表3 健康人與糖尿病患者MTHFR基因型分布頻率表

對照組與糖尿病組MTHFR677等位基因概率經χ2檢驗，可知(χ2=0.331，P>0.05)，其等位基因分布頻率沒有顯著性差異。對照組與糖尿病組MTHFR677基因CC/CT/TT三種基因型頻率，經χ2檢驗，可知(χ2=12.647，P<0.05)，三種基因型分布頻率有顯著性差異性，具有統計學意義。

4 討論

TCF7L2基因(又稱T細胞因子-4)是Wnt信號傳導通路中的轉錄因子，參與細胞增殖與分化的調節[5]，它位于人類10號染色體長臂25區(染色體10q25.3)，共有2159個堿基對，包含17個外顯子，其表達產物是T細胞因子/淋巴細胞增強子結合因子中的一個。一些研究認為TCF7L2基因變異與2型糖尿病相關[7]，但是同時也有研究認為沒有關聯[8]。這可能是不同的研究者選取的基因位點及病例入選標準不同有關。總之關于TCF7L2基因多態性與2型糖尿病的關聯還沒有定論，有必要進行大樣本深入研究。本試驗研究本地區健康人TCF7L2TSNPrs12255372基因多態性與2型糖尿病患者的基因多態性不相關。MTHFR基因位于染色體1q36.3，編碼區長1980bp，MTHFR基因的677位堿基胞嘧啶(Cytosine,C)變異為胸腺嘧啶(Thymine,T)，使編碼的丙氨酸(Ala)變異為纈氨酸(Val)[9]而產生多態性，它與很多疾病相關[10]，本實驗表明MTHFRSNPrs1801133三種基因型分布頻率在黑龍江省佳木斯地區健康人和糖尿病患者中有顯著性差異性。胰島素受體底物1(IRS-1)基因突變導致胰島素對血小板活性的抑制作用削弱，導致胰島素抵抗。胰島素受體底物1(IRS-1)廣泛存在于胰島素敏感的組織中，在胰島素受體信號傳導通路中處于關鍵部位，是胰島素受體激酶的第一個直接底物。本實驗對IRS-1SNPrs2943650基因CC/CT/TT三種基因頻率進行統計分析，經χ2檢驗，可知(χ2=2.117，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統計學意義。

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佳木斯大學科學技術面上項目，編號：S2014-031。

方舟(1984～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主管藥師。

李艷翠(1973～)女，黑龍江鶴崗人，碩士，主任藥師。E-mail:liyancui3400@163.com。

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1008-0104(2017)03-0084-03

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