PCDH10基因在結直腸癌組織中的表達①

姜文強，陳玉強，王彤旭，呂 鑫，王亞洲

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

PCDH10基因在結直腸癌組織中的表達①

姜文強，陳玉強，王彤旭，呂 鑫，王亞洲

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：檢測結直腸癌組織及對應的癌旁正常組織中PCDH10基因表達mRNA水平及其啟動子區域甲基化狀態，探究該基因在結直腸癌發生發展中的作用。方法：選取2016-01～2017-02于佳木斯大學附屬第一醫院普外科直接行手術切除治療的60例結直腸癌患者的腫瘤組織及對應的癌旁正常組織，采用甲基化PCR (MSP)和RT-PCR實驗技術，檢測兩者組織中PCDH 10基因啟動子甲基化狀態和mRNA水平情況，并根據臨床資料進行分析。結果：PCDH10基因在結直腸癌組織中見啟動子明顯異常甲基化，比例為53.3%(32/60)，遠高于癌旁組織8.3%(5/60)，二者差異具有顯著統計學意義(P<0.01)；在結直腸癌組織中其mRNA表達只有8.3%(5/60)，大多數表達沉默，而在癌旁組織中高表達90%(54/60)，二者差異具有統計學意義(P<0.05)；PCDH10基因異常甲基化與結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小未見相關(P>0.05)，與Dukes分期、分化程度、淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。結論：PCDH10基因在結直腸癌組織中表達大多數沉默，但其啟動子異常甲基化顯著，說明該基因可能在結直腸癌的發生、發展中具有抑制作用。

結直腸癌；PCDH10；甲基化；mRNA表達

在我國結直腸癌的發病率為9.2-17.0/10萬，并且有逐年上升趨勢，發病人群也有年輕化趨勢，因此結直腸癌一直在我國消化道腫瘤研究領域中，是重點研究的惡性腫瘤之一[1]。PCDH10基因是新近發現的原鈣黏蛋白基因，其編碼蛋白參與細胞分化、細胞間黏附及信息傳遞等重要功能[2，3]。近年來，多項研究表明，PCDH10基因啟動子異常甲基化和表達異常，發生在宮頸癌、鼻咽癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、肝癌等多種惡性腫瘤中，說明該基因對抑制腫瘤生長、遷移、浸潤及轉移有密切的關系[4]。本研究檢測結直腸癌組織及對應癌旁正常組織中PCDH10基因啟動子甲基化狀態和mRNA水平情況，并根據臨床資料進行分析，探討PCDH10基因在結直腸癌的發生及進展中的作用，為最終可能成為新的治療手段和抗腫瘤藥物的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

取自2016-01～2017-02于佳木斯大學附屬第一醫院普外科，直接行手術切除治療而未行任何輔助治療的患者60例。其中男36例，女24例；年齡38～80歲，中位年齡60.5歲；結腸癌39例，直腸癌21例；腫瘤直徑>4cm28例，≤4cm32例；高中分化37例，低分化23例；Dukes分期A+B期45例，C+D期15例；有淋巴轉移16例，未見淋巴轉移44例。從手術室獲取組織標本后，保存在液氮罐中，登記編號后置于-80℃冰箱中儲存，用于提取相關實驗材料。手術切除的腫物經病理科診斷證實為結直腸癌組織(腺癌)；對照組為手術切除配對的癌旁組織(距腫瘤切緣5cm以上)，并在病理科診斷證實為良性組織。本實驗中所有患者均已知情同意，并且經過佳木斯大學附屬第一醫院倫理道德委員會批準同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 染色體DNA提取：按照DNA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國)及DNA甲基化試劑盒(QIAGEN公司，德國)說明書操作步驟分別進行DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾，每次進行修飾的DNA量為1μg，經過修飾的DNA立即進行MSP檢測，或置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2MSP檢測PCDH10基因啟動子甲基化狀態：引物參照文獻[4]中的序列，由上海生工生物工程有限公司合成,甲基化上游引物序列為5'-TCGTTAAATAGATACGTTACGC-3'；下游引物序列為5'-TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG-3'；非甲基化上游引物序列為5’-GTTGTTAAATAGATATGTTATGT-3'；下游引物序列為5'-CTAAAAACTAAAAACTTTCCACA-3’。MSP反應體系為25μL， 反應條件為：95℃預變性10min；94℃變性30s，甲基化引物退火60℃(非甲基化引物退火58℃) 30s,72℃延伸30s，一共40個循環，最后72℃延伸5min。無菌去離子水作為空自對照。

1.2.3 從組織標本中提取總RNA：按照Trizol試劑(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)提取組織標本RNA，采用Fermentas(美國)的DNA提取試劑盒合成cDNA，轉錄所得的cDNA儲存于-20℃作為模板用于半定量RT-PCR。

1.2.4 采用RT-PCR：PCR反應體系為25μL，按照試劑盒(QIAGEN，德國)的要求所有操作都在冰上進行以基因組DNA為模板的PCR反應體系及反應條件如下:1)反應體系：模板基因組DNA1μL,Hotstart聚合酶0.125μL、10UmPCDH10上下游引物各0.75μL、10UmGAPDH上下游引物各0.5μL、dNTP(10Mm) 0.5μL、10xreactionbuffer2.5μL、Q-SOLUTION5μL、ddH20 13.5μL。2)反應條件：95℃預變性15min；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 40s，10個循環；95℃ 30s，52℃ 30s， 72℃ 40s， 24個循環；72℃ 10min。最后1.5%的瓊脂糖檢測PCR產物大小，凝膠成像分析儀成像。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0軟件，采用卡方檢驗方法進行，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1PCDH10甲基化情況

在結直腸癌組織中，PCDH10基因明顯異常甲基化，比例為53.3%(32/60)，遠高于癌旁組織8.3%(5/60)，二者差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2PCDH10基因mRNA水平表達

PCDH10癌旁組織中高表達90%(54/60)；在絕大多數結直腸癌組織中mRNA表達沉默，二者差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 結直腸癌組織和癌旁組織中的PCDH10基因甲基化水平

表2 結直腸癌組織和癌旁組織中的PCDH10基因mRNA水平

2.3 甲基化情況水平與患者臨床病理特征

PCDH10基因異常甲基化與結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤大小未見相關(P>0.05)，但與Dukes分期、分化程度、淋巴結轉移密切相關(P<0.05)，見表3。

表3 PCDH10在原發結直腸癌組織中的甲基化情況水平與患者臨床病理特征的相關性分析

3 討論

隨著對腫瘤的成因及致病機制不斷深入研究發現，表觀遺傳學異常是腫瘤形成的重要機制，其中較深入研究是DNA甲基化[5]。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色質結構、DNA穩定性、DNA構象及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制表達[6～8]。PCDH10基因(又稱為OL-protocadherin和KIAA1400)，位于染色體4q28.3，長約42.26kb。早期對PCDH10研究主要集中在神經系統方面，認為其異常表達可以影響神經元活性，是自閉癥相關基因；近來有研究表明其異常表達可以抑制腫瘤細胞生長、遷移、浸潤和集落形成[9]。本研究中，結直腸癌患者腫瘤組織中，PCDH10基因明顯異常甲基化高于癌旁正常組織；而癌旁正常組織中PCDH10高表達遠高于結直腸癌組織，表明該基因異常甲基化及表達沉默可能參與結直腸癌發生；PCDH10基因異常甲基化與患者臨床分期、分化程度、淋巴結轉移密切相關，提示該基因甲基化在結直腸癌惡性進展中有影響。綜上所述，PCDH10基因在結直腸癌發生發展中具有重要作用，這對進一步研究結直腸癌的發病機制、臨床治療有著重要意義，最終可能成為新的治療手段和抗腫瘤藥物的研發提供理論依據。

[1]包合新，李建國，邢桂濱.EZH2和Bmi-1 基因在結直腸癌組織中的表達及其意義[J].黑龍江醫藥科學，2014，37(1)：10-12

[2] 王星權，王亞洲，陳玉強，等.Smad-4 在結直腸癌的表達及評價患者預后的研究[J].黑龍江醫藥科學，2015，38(6)：77-80

[3]ZhongX，ZhuY，MaoJ，etal.FrequentepigeneticsilencingofPCDH10bymethylationinhumancolorectalcancer[J].JCancerResClinOncol，2013,139(3)：485

[4]MaJG，HeZK，MaJH，etal.Downregulationofprotocadhcrin-10expressioncorrelateswithmxlitgnantbehaviourandpoorprognosisinhumanbladdercancer[J].JIntMedRes,2013，41 (1)：38

[5]LiY，YangZS，SongJJ，etal.Protocadherin-10isinvolvedinangiogenesisandmethylationcorrelatedwithmultiplemyeloma[J].IntJMolMed，2012，29(4)：704-710

[6]NolletF，KoolsP，vanRoyF.Phylogeneticanalysisofthecadherinsuperfamilyallowsidentification'ofsixmajorsubfamiliesbesidesseveralsolitarymembers[J].JMolBiol2000，299：551-728

[7]YuJ，ChengYY，TaoQ，etal.Methylationofprotocadherin10，anoveltumorsuppressor，isassociatedwithpoorprognosisinpatientswithgastriccancer[J].Gastroenterology，2009，136(2)：640-651

[8]El-OstaA，WolffeAP.DNAmethylationandhistonedeacetylationinthecontrolofgeneexpression:basicbiochemistrytohumandevelopmentanddisease[J].GeneExpr,2000,9(1-2)：63-75

[9]LiZ，ChimJC，YangM，etal.RoleofPCDH10anditshypermethylationinhumangastriccancar[J].BiochimBiophysActa,2012，1823(2)：298

佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：YM2016_043。

姜文強(1990～)男，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生，醫師。

陳玉強(1969～)男，黑龍江佳木斯人，博士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。E- mail: 522712134@qq.com。

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1008-0104(2017)03-0104-02

2016-12-04)