骨髓來源細胞表達的MMP-2/MMP-13在脈絡膜新生血管發生發展中的作用

呂 洋，李 紅，岳紅云，姚長江

·基礎研究·

骨髓來源細胞表達的MMP-2/MMP-13在脈絡膜新生血管發生發展中的作用

呂 洋，李 紅，岳紅云，姚長江

目的 探討骨髓來源細胞(BMCs)基質金屬蛋白酶(MMP)的動態表達及其與脈絡膜新生血管(CNV)發生、發展的關系。方法 選取成功接受骨髓移植的24只C57BL/6J綠色熒光蛋白(GFP)嵌合體小鼠為觀察組，未接受骨髓移植的48只C57BL/6J小鼠為對照組。兩組均予激光光凝照射以誘發CNV，利用Western blot法及明膠酶譜法檢測對照組在激光誘發前、誘發后1、3、5、7、10、14、28 d時MMP-2/MMP-13的表達情況，利用免疫熒光染色檢測觀察組CNV中GFP陽性細胞(即移植的骨髓細胞)是否表達MMP-2/MMP-13，并進行定量分析。結果 Western blot法、明膠酶譜法、免疫熒光均顯示在激光誘發早期兩組CNV中MMP-2的表達即開始快速增加，在誘導第3天表達量最高、活性最強，且觀察組BMCs表達MMP-2也在此時達到高峰，占總表達量的63.21%，隨后MMP-2表達量開始下降；在激光誘發早期兩組CNV中MMP-13的表達緩慢增加，在誘導后第7天表達量最高、活性最強，且觀察組BMCs表達MMP-13亦達最高峰，占總表達量的77.87%，隨后下降。結論 BMCs可能作為調控靶點改變MMP-2/MMP-13的表達，進而影響血管細胞的出芽、移行、凋亡及CNV纖維化。

脈絡膜新生血管化；骨髓來源細胞；基質金屬蛋白酶

脈絡膜新生血管(CNV)是來自脈絡膜毛細血管的增殖血管，多位于黃斑部，是目前臨床40余種眼病共同的病理過程，可造成嚴重的視力損害[1]。近年研究發現，基質金屬蛋白酶(MMPs)在CNV形成過程中發揮重要作用，其參與細胞移行，降解細胞外基質，促進新生血管出芽，有利于骨髓來源細胞(BMCs)趨化參與新生血管形成[2]。CNV原位細胞表達MMPs是有限的，BMCs參與CNV生成可能是MMPs的重要來源[3-7]。本研究探討參與CNV生成的BMCs是否為MMPs的重要來源及其對CNV發生、發展的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 兔抗小鼠MMP-2/MMP-13多克隆抗體(美國Abcam公司)，羊抗兔IgG二抗(美國BioLab公司)，DyLight594標記的羊抗兔抗體(美國Earth公司)。

1.2 動物來源及分組 采用6～8周齡綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)雌性轉基因小鼠作為骨髓移植供體，體重18～24 g，由第四軍醫大學神經生物學教研室惠贈；受體鼠為6～8周齡的野生型雌性C57BL/6J小鼠，體重18～24 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，其中接受骨髓移植的26只C57BL/6J GFP嵌合體小鼠為觀察組，未接受骨髓移植的48只C57BL/6J小鼠為對照組。

1.3 骨髓移植及嵌合程度分析 ①骨髓移植：觀察組行60Co照射，總劑量為8.0 Gy，1.0 Gy/min。照射后12 h內經尾靜脈注射制備好的BMCs細胞懸液，每只300 μl[5]；②嵌合程度分析：移植后28 d采用流式細胞儀分析血液樣本中表達GFP的細胞在單核細胞中所占比例[8]。

1.4 激光光凝照射誘發CNV 對照組48只小鼠與觀察組骨髓移植成功的24只小鼠均行激光光凝照射，波長532 nm，時間0.1 s，光斑直徑75 μm，功率100 mw，每只眼6～8個激光斑，距視盤1～1.5個盤直徑[9]。

1.5 Western blot法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 取24只小鼠，隨機分為激光誘發前、誘發后第1、3、5、7、10、14、28天，每個時間點3只，將小鼠眼球的視網膜及脈絡膜組織加入細胞裂解液制備的蛋白樣品中，120 V電壓下4℃電泳2 h。利用電轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜上，室溫封閉2 h，將濾膜與兔抗鼠多克隆一抗MMP-2/MMP-13(濃度分別為1∶4000、1∶5000)混勻后于4℃下封閉過夜，后用TBST沖洗濾膜3次，將膜轉移至羊抗兔IgG二抗(濃度為1∶1000)于37℃孵育2 h，TBST再次沖洗濾膜，使用化學發光顯影檢測器觀察，應用UVP圖像分析軟件進行分析。

1.6 明膠酶譜法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 取24只小鼠，隨機分為激光誘發前、誘發后第1、3、5、7、10、14、28天，每個時間點3只，將小鼠眼球的視網膜及脈絡膜組織勻漿、離心制備成蛋白抽提液，取5 μl上樣于含0.1%明膠的8%聚丙烯酰胺凝膠中進行SDS-PAGE電泳(血漿樣品先經1∶40稀釋后再上樣)。電泳結束后將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L CaCl2，1 μmol/L ZnCl2；pH 7.6)中振蕩洗脫2次，每次45 min，再用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脫液)漂洗2次，每次20 min，以上均在4℃環境中進行，再將凝膠置于37℃的孵育液(50 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/ L CaCl2,1 μmol/L ZnCl2，0.02% Brij-35；pH 7.6)中孵育42 h。孵育結束后經染色液(0.05% Coomassic亮藍、30%甲醇、10%乙酸)染色3 h，脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%，乙酸濃度分別為10%、10%、5%)分別脫色0.5、1及2 h，可見MMP-2和MMP-13位于藍色背景的透亮帶上。此凝膠成像以反轉模式打印，使酶解活性表現為黑色條帶，經圖像分析系統讀取條帶面積和灰度。條帶酶解量=條帶面積×(條帶灰度-背景灰度)，比活=酶解量÷樣品蛋白濃度，用以反映酶含量。

1.7 免疫熒光染色觀察MMP-2/MMP-13的表達 取觀察組、對照組各24只小鼠，隨機分為激光誘發前、誘發后第1、3、5、7、10、14、28天，每個時間點3只。在-20℃環境下做垂直于視網膜8～10 μm的冰凍切片，經干燥、封閉后與兔抗小鼠MMP-2/MMP-13多克隆抗體(濃度分別為1∶200、1∶300)室溫孵育過夜，洗滌后滴加紅色熒光標記的山羊抗兔IgG抗體(濃度為1∶300)，室溫孵育3 h，洗滌、封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。以PBS代替一抗作空白對照。觀察CNV中GFP陽性細胞(即移植的骨髓細胞)表達MMP-2/MMP-13的情況。顯微鏡下BMCs標記為綠色熒光，MMP-2/MMP-13為紅色熒光，兩者共同聚焦部分為黃色熒光。采用Image J測量BMCs表達的MMP-2/MMP-13的面積(黃色)和CNV表達MMP-2/MMP-13總面積(紅色)(以像素為單位)。分析CNV中MMP-2/MMP-13的表達總量及BMCs表達構成比。

2 結果

2.1 骨髓移植后嵌合程度分析 觀察組骨髓移植28 d后嵌合度>85%共24只，成功率為92.31%，其外周血單核細胞中GFP細胞所占比例平均(90.83±3.68)%，符合后期實驗要求[7]，見圖1。

圖1 流式細胞儀分析兩組小鼠骨髓嵌合程度

1a.對照組骨髓細胞流式分析結果示：大部分骨髓細胞為陰性;1b.觀察組骨髓細胞流式分析結果示：大部分骨髓細胞為陽性

2.2 Western blot法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 隨著時間的延長，MMP-2/MMP-13的表達大體呈先升高后下降的趨勢，均在激光誘發前表達量最低，MMP-2在激光誘發后第1天開始快速增加，第3天達高峰，隨后下降；MMP-13在激光誘發后第1天緩慢增加，第7天達高峰，隨后下降，見表1、圖2。

表1 Western blot法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量的變化

2.3 明膠酶譜法檢測對照組CNV中MMP-2/MMP-13的表達 隨著時間的延長，MMP-2/MMP-13的表達大體呈先升高后下降的趨勢。MMP-2在激光誘發前活性最低，激光誘發后第1天開始增加，第3天活性最強，隨后開始下降；MMP-13在激光誘發后第1天活性最低，隨后開始增加，第7天活性最強，隨后開始下降，見表2、圖3。

2.4 觀察組MMP-2/MMP-13的水平變化 觀察組免疫熒光圖像顯示，激光誘發后GFP陽性的BMCs在CNV區域聚集，同時表達MMP-2/MMP-13(圖4)。采用Image J分析發現BMCs表達的MMP-2在誘發早期即開始快速增加，第3天到達高峰，占總表達量的63.21%，隨后開始下降；MMP-13在誘發早期開始緩慢增加，第7天表達量達高峰，占總表達量的77.87%，隨后開始下降，與不同時間點總表達趨勢一致，見圖5。對照組免疫熒光染色未見綠色熒光，說明綠色熒光確由供體鼠骨髓細胞發出。

圖2 Western blot法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量變化

2a為MMP-2/MMP-13代表性蛋白條帶圖，2b為MMP-2/MMP-13蛋白表達量比較

表2 明膠酶譜法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量的變化

3 討論

因各種原因造成的視網膜缺血、缺氧，均可誘導來自脈絡膜的病理性新生血管侵入視網膜，損傷正常的脈絡膜及視網膜結構，導致出血，是進行性視力損傷的主要原因之一，嚴重影響生活質量。有研究證實，BMCs能移行至病變損傷部位，分化為多種細胞，參與CNV的發生、發展，還可作為載體，將藥物、藥物激活物質等帶到損傷部位，起到靶向治療作用[4,10]。

圖3 明膠酶譜法檢測對照組脈絡膜新生血管在不同時間點MMP-2/MMP-13相對表達量的變化

3a為MMP-2/MMP-13代表性蛋白條帶圖，3b為MMP-2/MMP-13蛋白表達量比較

MMPs是CNV生成所必需的物質[4,7]，是一類在結構上具有顯著同源性鋅離子依賴性內肽酶[4,7]，可降解膠原活性，主要降解血管基底膜和細胞外基質。CNV生成時先在MMPs作用下分解基底膜與細胞外基質，后血管內皮細胞(VEC)方能分裂增殖形成幼芽，進而發展為CNV。因此，MMPs是CNV生成的基礎，其中MMP-13主要降解Ⅰ、Ⅲ型膠原，MMP-2主要降解Ⅳ、Ⅴ型膠原。有研究顯示堿性成纖維細胞生長因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)為MMP-2底物[4,7]，是目前已知的功能最強大的內源性新生血管抑制因子，能促進VEC凋亡,抑制VEC增殖和移行，下調血管內皮生長因子(VEGF)的表達，阻止其與受體結合，減少VEGF誘發的血管滲漏并抑制炎癥反應，且PEDF可阻止神經元凋亡，從而保護視網膜。

圖4 免疫熒光檢測觀察組脈絡膜新生血管MMP-2/MMP-13的表達情況(骨髓來源細胞為綠色，MMP-2/MMP-13為紅色，兩者共同表達區域為黃色)

4a為激光誘發后第3天MMP-2與骨髓來源細胞的表達，4b為激光誘發后第7天MMP-2與骨髓來源細胞的表達，4c為激光誘發后第7天MMP-13與骨髓來源細胞的表達，4d為激光誘發后第28天MMP-13與骨髓來源細胞的表達；GFP為綠色熒光蛋白；DAPI為細胞核特異性標志物

圖5 觀察組脈絡膜新生血管在不同時間點骨髓來源細胞MMP-2/MMP-13的表達構成比

5a為激光誘發后各時間點MMP-2的總表達量及其構成比，5b為激光誘發后各時間點MMP-13的總表達量及其構成比

眼內的PEDF主要來源于視網膜色素上皮(RPE)細胞，CNV區域PEDF表達顯著下調，而CNV的形成可發揮營養神經及保護作用，因此，PEDF是CNV相關疾病的理想治療因子。本研究證明，在激光誘發后，MMP-2/MMP-13的表達大體呈先上升后下降的趨勢，且MMP-2的表達升高更早。MMP-2與MMP-13的表達上調可降解CNV基底膜和細胞外基質Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型膠原，為血管細胞的增殖、移行、出芽創造條件，促進CNV早期的快速發展。PEDF是CNV最強的內源性抑制因子，有研究發現處于活動期富含血管的CNV中VEGF和PEDF均高表達，而在靜止的、纖維化的CNV中二者的表達均較弱[11]，提示VEGF表達上調是CNV發生、發展的啟動因素，且在VEGF誘導PEDF上調這一反饋機制的作用下，PEDF濃度亦升高。PEDF為MMP-2底物，其對PEDF的降解可促進CNV形成和視網膜損傷[12]。本研究發現激光誘發早期MMP-2表達迅速上調，對于打破VEGF與PEDF的平衡及激發新生血管的形成非常重要；在激光誘發后期，MMP-2表達下調，對PEDF的降解作用減弱，促使了血管膜纖維化。

激光誘發后7～14 d是CNV生長高峰期[13]，BMCs在CNV早期即開始聚集[6]，于激光誘發后第7天BMCs熒光強度最強[3]，MMP-13的表達亦達高峰，占MMP-13總表達量的77.87%，與Lecomte等[7]結果一致,提示BMCs對CNV生成時MMP-13的迅速上調起主要作用,同樣說明在MMP-2表達高峰期，大部分來自BMCs，說明BMCs對MMP-2的表達上調亦起主要作用。BMCs不但參與CNV的細胞構成，同時為CNV生成提供重要的分子基礎。由此推測，BMCs可通過分泌MMP-2/MMP-13而作用于CNV發生、發展的多個環節，對CNV的病理過程產生影響，且MMP-2與MMP-13在BMCs參與CNV發生發展過程中可能扮演關鍵角色[14-15]。

在激光誘導小鼠CNV模型中，BMCs是MMP-2/MMP-13的重要來源，提示BMCs可能作為調控靶點以改變MMP-2/MMP-13的表達，進而影響血管細胞的出芽、移行、凋亡及CNV纖維化。本研究從BMCs參與CNV發生發展的角度探索CNV的發病機制，尋找一個新的、更高效的分子靶點，實現對CNV的多角度治療，從而為臨床工作提供新的理論依據。

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Effect of MMP-2/MMP-13 Expression by Bone Marrow-derived Cells in Development of Choroidal Neovascularization

LYU Yang1, LI Hong1, YUE Hong-yun1, YAO Chang-jiang2
(1. Department of Ophthalmology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730000, China; 2. Department of Osteology, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Objective To investigate matrix metalloproteinase (MMP) dynamic expression by bone marrow-derived cells (BMCs) and its relationship with pathogenesy and development of choroidal neovascularization (CNV). Methods A total of 24 C57BL/6J green fluorescent protein (GFP) of allophenic mice, who underwent bone marrow transplantation successfully, were selected as observation group, while other 48 C57BL/6J mice without bone marrow transplantation were selected as control group. CNV was induced by irradiating with laser photocoagulation for all mice. In control group, MMP-2/MMP-13 expressions were detected by Western blot and gelatin zymography method before induction, and at 1st, 3rd, 5th, 7th, 10th, 14thand 28thd after induction; In observation group, immunofluorescence staining was used to identify whether or not MMP-2/MMP-13 was expressed by GFP -positive BMCs in CNV, and quantitative analysis was also performed. Results Western blot, gelatin zymography and immunofluorescence staining methods all showed that MMP-2 expressions were rapidly increased in the early laser stage of CNV patients in two groups, and the expressions of BMCs and MMP-2 reached the highest values and strongest activity at 3rdd after induction; the highest value of MMP-2 expression in observation group occupied 63.21% of the total expression; and then MMP-2 expression began to decline. MMP-13 expression showed slowly increases at the early laser stage of CNV patients in two groups, and the highest expression and strongest activity were found at 7thd after induction; the highest values of MMP-13 expression in CNV patients in two groups and in observation group occupied 77.87% of the total expression; and then MMP-13 expression began to decline. Conclusion BMCs can be used as target point to regulate MMP-2/MMP-13 expression, and it can further affect pullulation, transmigration, apoptosis and fibration of CNV.

Choroidal neovascularization; Bone marrow derived cells; Matrix metalloproteinase

國家自然科學基金資助項目(81500748)；甘肅省自然基金項目(1308RJZA249)

730000 蘭州，蘭州軍區蘭州總醫院眼科(呂洋、李紅、岳紅云)；730000 蘭州，蘭州大學第二醫院骨科(姚長江)

姚長江，E-mail：15117203811@163.com

R773.4

A

1002-3429(2017)06-0103-05

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.06.036

2017-02-27 修回時間：2017-03-28)