RNA干擾核糖核苷酸還原酶M2對耐藥卵巢癌細胞凋亡及侵襲性的影響

劉 青, 牛 茹, 井松梅

(江蘇省徐州市中心醫院, 1. 婦科; 2．肛腸科; 3. 骨科, 江蘇 徐州, 221009)

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RNA干擾核糖核苷酸還原酶M2對耐藥卵巢癌細胞凋亡及侵襲性的影響

劉 青1, 牛 茹2, 井松梅3

(江蘇省徐州市中心醫院, 1. 婦科; 2．肛腸科; 3. 骨科, 江蘇 徐州, 221009)

目的 探討RNA干擾核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)對耐藥卵巢癌細胞凋亡及侵襲性的影響。方法 將RRM2基因的特異性小干擾(siRNA)轉染SKOV3/DDP設為干擾組, SKOV3/DDP細胞、SKOV3/DDP-RRM2非特異性陰性細胞設為空白組、陰性組。檢測細胞增殖抑制率，計算RI、耐藥轉染率，熒光PCR技術檢測RRM2基因mRNA表達，并分析siRNA轉染對SKOV3/DDP耐藥指數、RRM2蛋白的影響，采用Transwell觀察SKOV3/DDP細胞侵襲能力。結果 空白組、陰性組及干擾組轉染率均>90%。DDP對SKOV3/DDP細胞屬低度耐藥，吉西他濱對SKOV3/DDP細胞仍較為敏感。DDP、吉西他濱對干擾組、陰性組、空白組的DDP對細胞的半數抑制濃度(IC50)值比較，差異有統計學意義(P<0.05), DDP、吉西他濱對干擾組細胞的IC50值顯著低于陰性組、空白組(P<0.05)。SKOV3/DDP細胞、SKOV3細胞RRM2蛋白的相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且轉染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組相對表達量均顯著低于陰性組、空白組，其中以轉染Ⅰ組細胞的RRM2蛋白相對表達量下降最顯著(P<0.05)。干擾組細胞凋亡率顯著高于空白組、陰性組，穿膜細胞數顯著低于空白組、陰性組(P<0.05)。結論 siRNA可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的增殖與侵襲性，增加耐藥細胞的藥物敏感性，尤其是促進DDP誘導的耐藥細胞凋亡。

siRNA; 核糖核苷酸還原酶M2; 卵巢癌; 耐藥; 細胞凋亡

卵巢上皮性癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其致死率在婦科腫瘤中居首位，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，近年來其臨床發病呈低齡化趨勢，卵巢癌患者的5年存活率較低，而及早診斷與治療對改善患者生存質量及延長生存期至關重要[1-2]。在臨床實際中，由于卵巢癌患者早期無典型癥狀，確診時多數已至晚期，手術、放化療雖可取得一定的療效，但目前手術切除率仍較低，放化療毒副作用大，卵巢癌的生存率不容樂觀(5年僅為30%左右)[3-5]。目前卵巢癌的治療仍以減瘤術聯合鉑類為主的化療綜合方案，但患者經初次治療后有60%以上的患者可復發。目前化學藥物抗腫瘤治療作用機制主要為誘導腫瘤細胞凋亡[6]。卵巢癌細胞對放、化療的效果主要受其發生細胞死亡的傾向的影響，故認為卵巢癌治療失敗的主要原因為癌細胞對藥物所致凋亡的抵抗性和獲得性耐藥。核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)基因在眾多惡性腫瘤中過表達，作為細胞凋亡的主要調控基因之一，其活性高低與惡性腫瘤的生長和浸潤能力呈正相關，與腫瘤耐藥的形成亦有密切關系[7]。本研究探討通過RNA干擾(RNAi)RRM2對耐藥卵巢癌細胞凋亡及侵襲性的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

卵巢癌細胞株SKOV3產自北京北納生物科技有限公司，耐順鉑的卵巢癌細胞SKOV3/DDP采用間歇濃度梯度遞增法經過9個月誘導成功，呈低度耐藥細胞(耐藥系數3.6); DMEM-F12細胞培養液、胰蛋白酶、陽離子脂質體Lipofectamine TM2000均購自上海北諾生物科技有限公司; MTT購自美國PMSF: Serva公司，鼠抗人RRM2單克隆抗體購自美國novus公司; 順怕(DDP)購自山東齊魯制藥有限公司，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠多克隆抗體購自上海博耀生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立耐藥細胞系SKOV3/DDP: 采用含10%小牛血清的DMEM-F12培養基中培養SKOV3細胞，置于環境適宜的(37 ℃、5% CO2)孵箱中培養，觀察細胞生長情況。以間歇梯度遞增誘導法在6孔板中接種SKOV3細胞，培養24 h后于6孔板中加入不同終濃度DDP，培養基中繼續培養，起始濃度選取能殺死50%細胞的細胞半數抑制濃度(IC50), 即0.5 μg/mL; 細胞穩定生長進入指數期后進行胰蛋白酶等傳代2次，然后同一劑量藥物重復培養; 穩定后在0.8 μg/mL DDP藥物濃度的培養液中繼續培養; 遞增藥物濃度后再培養，共培養9個月。

1.2.2 MTT法檢測：上述培養于脫藥培養2個月后以MTT法檢測耐藥細胞在傳代、凍存后耐藥指數(RI)不變的情況下進行實驗。SKOV3/DDP細胞的RI取對數生長期SKOV3細胞、SKOV3/DDP細胞分別配制單細胞懸液，并以1×104個/孔接種于96孔板中(終體積200 μL/孔); 于培養24 h后加入不同終質量濃度的DDP與吉西他濱，設置5個復孔，孔板中加相同終體積的培養液; DDP與吉西他濱作用48 h后，每孔加入新配置的MTT溶液(5 mg/mL), 繼續培養4 h后去掉上清液; 繼續每孔加入DMSO(150 μL)后避光低速振蕩至結晶物溶解; 通過酶聯免疫檢測法測定各孔的吸光度(波長取570 mm)。細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組孔吸光度-調零孔吸光度)/(空白對照孔吸光度-調零孔吸光度)]×100%。選用統計學軟件SPSS 19.0分析并計算DDP對細胞的半數抑制濃度(IC50), 并計算RI(RI<5時為低耐藥), RI=IC50(SKOV3/DDP)/IC50(SKOV3)。

1.2.3 脂質體介導小干擾RNA(siRNA)轉染：根據RRM2基因序列和siRNA設計原則，設計RRM2基因的siRNA序列與非特異性陰性siRNA對照序列，見表1。轉染前24 h SKOV3/DDP細胞取對數生長期細胞以6×105個/孔接種于6孔板，待其生長至60%后以siRNA轉染，操作嚴格按照脂質體試劑說明書進行。

表1 RRM2基因的siRNA序列設計及非特異性陰性siRNA對照序列設計

1.2.4 檢測RRM2基因mRNA表達：于轉染后不同時期(24、48、72、96 h)分別提取對數生長期空白組(SKOV3/DDP細胞)、陰性組(SKOV3/DDP-RRM2非特異性陰性細胞)及干擾組(SKOV3/DDP-RRM2-RNAi細胞)的總RNA, 采用熒光PCR技術檢測RRM2基因mRNA表達，以驗證siRNA的干擾效果，引物序列見表2。PCR反應條件下40個循環，采集熒光信號80 ℃ 30 s, 以△△Ct法[6]重復3次計算RRM2mRNA表達水平，取平均值。

表2 引物序列及擴增基因片斷

1.2.5 卵巢癌細胞凋亡：對數生長期細胞按5×104個/孔接種于6孔板，于轉染siRNA 24 h后加入DDP+吉西他濱(濃度10 μg/mL), 采用細胞凋亡檢測試劑盒和流式細胞儀于聯合作用24、48、72、96 h后行細胞凋亡檢測。

1.2.6 Transwell觀察SKOV3細胞侵襲能力：于Transwell小室中孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔膜上模擬人工基底膜，轉染后6 h消化、離心重懸細胞，將細胞懸液接種含趨化因子與培養液的6孔板，然后在Transwell小室37 ℃、5%CO2環境下孵育24 h, 顯微鏡下觀察穿膜情況。

2 結 果

2.1 siRNA轉染對SKOV3/DDP耐藥指數的影響

RRM2siRNA轉染SKOV3/DDP細胞后4～6 h,空白組、陰性組及干擾組轉染率均>90%。靶向RRM2基因的RNAi使耐藥細胞對DDP的敏感度上調, MTT檢測結果顯示, DDP對SKOV3/DDP細胞的耐藥系數為3.6，屬低度耐藥，吉西他濱對SKOV3/DDP細胞PI為1, 仍較為敏感。DDP、吉西他濱對干擾組、陰性組、空白組的IC50值比較，差異有統計學意義(P<0.05), DDP、吉西他濱對干擾組細胞的IC50值顯著低于陰性組、空白組(P<0.05)。見表3。

表3 DDP、吉西他濱對SKOV3/DDP細胞增殖抑制率的影響 μg/mL

與空白組比較, *P<0.05; 與陰性組比較, #P<0.05。

2.2 siRNA轉染對RRM2蛋白的影響

SKOV3/DDP細胞RRM2蛋白的相對表達量為(0.89±0.05), SKOV3細胞RRM2蛋白的相對表達量為(0.39±0.01), 差異有統計學意義(F=4.12,P<0.05)。轉染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ 組相對表達量依次為(0.07±0.01)、(0.30±0.01)、(0.13±0.01), 均顯著低于陰性組、空白組相對表達量(0.72±0.03)、(0.56±0.04)，其中以轉染Ⅰ組細胞的RRM2蛋白相對表達量下降最顯著(F=8.08,P<0.05)。

2.3 siRNA轉染對SKOV3/DDP細胞凋亡及侵襲性的影響

干擾組細胞凋亡率顯著高于空白組、陰性組，穿膜細胞數顯著低于空白組、陰性組(P<0.05), 空白組、陰性組細胞凋亡及侵襲性比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 siRNA轉染對SKOV3/DDP細胞凋亡及侵襲性的影響

與空白組比較, *P<0.05; 與陰性組比較, #P<0.05。

3 討 論

多數用于卵巢癌的化療藥物初用時較為敏感，但隨后卵巢癌細胞可能通過改變控制凋亡級聯的分子機制而產生耐藥，甚至增加治療后復發轉移風險[8]。對卵巢癌患者而言，癌細胞耐藥是影響臨床化療效果不滿意、復發或轉移及死亡率居高不下的重要因素，而提高化療敏感性對促進腫瘤細胞凋亡至關重要[9]。早期有研究[10]指出，調控凋亡信號轉導途徑中相關細胞內的調控因子有機會使得腫瘤細胞對順鉑、吉西他濱等藥物的敏感性增加。

RRM2存在于多數真核細胞中，是蛋白質翻譯后修飾酶，亦是促進DNA合成與修復的關鍵限速酶，在生物學行為中，RRM2對DNA損傷修復與細胞凋亡有重要的影響，已有大量臨床薈萃分析[11-13]表明RRM2與癌腫生物學行為有直接相關性。尋慶英等[14]檢測到了RRM2在子宮內膜癌中的表達部位和表達水平均可影響Ishikawa細胞增殖及侵襲能力，并以基因的mRMA證實其存在著高表達，并推測可通過阻斷RRM2的表達來抑制腫瘤的發生、發展和治療效果。目前，RNA干擾技術是一項特異性抑制基因表達的成熟方法，又為被稱為基因沉默療法，與傳統的抑制基因功能的治療方案相比，尤其是一些短的雙鏈RNA即 siRNA具有快速、高效、特異地降解相關基因的mRNA等特點[15]。陳昌賢等[16]的研究亦基于microRNA調控網絡分析預測卵巢癌多藥耐藥的相關基因。RNA以DNA的一條鏈為模板，具有實現遺傳信息在蛋白質上表達作用，而指外源性或內源性的雙鏈RNA與細胞內含有互補序列的mRNA識別并結合后可在酶的作用下降解mRNA，從而產生干擾相應基因表達、發揮基因敲除的功能，如卵巢癌SKOV3細胞侵襲能力和增殖能力可受siRNA干擾的影響，主要與siRNA可有效逆轉腫瘤細胞的耐藥性有關[17]。另一方面，卵巢癌細胞SKOV3增殖和遷移能力常常與耐藥有關，在相關基因實驗[18]中常見報道。本研究中，空白組、陰性組及干擾組轉染率均>90%。DDP對SKOV3/DDP細胞屬低度耐藥，吉西他濱對SKOV3/DDP細胞仍較為敏感，結合轉染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ 組SKOV3/DDP細胞、SKOV3細胞RRM2蛋白的相對表達量，可分析卵巢癌SKOV3細胞RRM2蛋白呈過量表達，且其與患者耐藥具有密切的關系，同時選擇有效的基因沉默靶序列對研究該基因的生物學功能有重要影響。王兆永等[19]分析指出，RRM2蛋白呈過量表達可預測腫瘤耐藥性與治療效果不佳，與龍映妃等[20]關于卵巢癌SKOV3細胞RRM2表達的相關研究結論一致。

本研究中, SKOV3/DDP細胞、SKOV3細胞RRM2蛋白的相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05), 且轉染Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ 組相對表達量均顯著低于陰性組、空白組，其中以轉染Ⅰ組細胞的RRM2蛋白相對表達量下降最顯著(P<0.05)。表明轉染RRM2的siRNA轉染后可能通過降解靶標基因而封閉RRM2基因表達，并阻斷其活性，從而在轉錄和翻譯水平分別起到抑制RRM2蛋白表達的作用。DDP、吉西他濱對干擾組、陰性組、空白組的DDP對細胞的半數抑制濃度(IC50)值比較，差異有統計學意義(P<0.05), DDP、吉西他濱對干擾組細胞的IC50值顯著低于陰性組、空白組(P<0.05)。提示轉染RRM2-RNAi可逆轉SKOV3/DDP的DDP耐藥性，使細胞對DDP的敏感性顯著增加，亦說明RRM2在卵巢癌化療耐藥中有負面作用，因此可作為改善DDP耐藥的治療分子靶點之一。張夢等[21]的實驗亦證實了這一觀點。因此，通過siRNA技術阻斷RRM2基因在卵巢癌化療DDP耐藥細胞SKOV3/DDP中的表達程度，結果顯示干擾組細胞凋亡率顯著高于空白組、陰性組，穿膜細胞數顯著低于空白組、陰性組(P<0.05)。表明siRNA可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的增殖率與侵襲性，增加其凋亡率，尤其是促進DDP誘導的耐藥細胞凋亡，故有望應用于卵巢癌化療并改善耐藥、降低復發的一線治療方案。

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Influence of RNA-interfered ribonucleotide reductase M2 on apoptosis and invasion of ovarian cancer cells with drug resistant

LIU Qing1, NIU Ru2, JING Songmei3

(1.DepartmentofGynecology; 2.DepartmentofAnorectalDisease; 3.DepartmentofOrthopedics,XuzhouCentralHospital,Xuzhou,Jiangsu, 221009)

Objective To investigate the influence of RNA-interfered ribonucleotide reductase M2 (RRM2) on apoptosis and invasion of ovarian cancer cells with drug resistant. Methods The specific small interfering (siRNA) transfected SKOV3/DDP of RRM2 gene were designed as the interference group. SKOV3/DDP cells, SKOV3/DDP-RRM2 non-specific negative cells were designed as the blank group and negative group. The cell proliferation inhibition rate was detected, RI and drug resistant transfection rate were calculated, the expression of RRM2 mRNA was detected by fluorescence PCR. The effect of siRNA transfection on SKOV3/DDP resistance index and RRM2 protein was analyzed, and the invasion ability of SKOV3/DDP cells was observed with Transwell. Results The transfection rate of the blank group, negative group and interference group was 90%. The drug resistance of DDPto SKOV3/DDP cells was low and gemcitabine was sensitive to SKOV3/DDP cells. DDP and gemcitabine of the DDP on cell half inhibitory concentration (IC50) values showed significant differences among three groups (P<0.05). IC50values of DDP and gemcitabine on cells in the interference group were significantly lower than the negative group and blank group (P<0.05).The relative expression of SKOV3/DDP cells and SKOV3 cells RRM2 protein showed significantdifferences (P<0.05), and the relative expression was significantly lower in transfection group I, transfection group II and transfection group III than the negative group and blank group (P<0.05). The decrease of relative expression of RRM2 protein was the greatest in the transfection group I (P<0.05). The apoptosis rate was significantly higher in the interference group than the blank group and the negative group, transmembrane cells were fewer than the blank group and the negative group (P<0.05). Conclusion siRNA can effectively inhibit the proliferation and invasion of RRM2 gene in ovarian cancer. It can increase the drug sensitivity of drug resistant cells, especially cells promoting the apoptosis of drug resistant cells induced by DDP.

siRNA; ribonucleotide reductase M2; ovarian cancer; drug resistance; apoptosis

2017-03-16

江蘇省徐州中心醫院創團隊科技項目 (XZS201626)

井松梅

R 737.31

A

1672-2353(2017)13-067-05

10.7619/jcmp.201713018