大孔樹脂吸附純化黔產龍膽草多糖工藝優化

宮江寧

饒 玉

楊義菊

陳 飛

(貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州 貴陽 550001)

大孔樹脂吸附純化黔產龍膽草多糖工藝優化

宮江寧

饒 玉

楊義菊

陳 飛

(貴州師范大學化學與材料科學學院，貴州 貴陽 550001)

采用硫酸—苯酚法測定多糖的含量，研究FL-3樹脂對龍膽多糖的吸附和洗脫效果。以多糖的吸附率和解吸量為指標,對FL-3樹脂純化龍膽多糖的工藝條件進行了研究。結果表明，FL-3樹脂對龍膽多糖的吸附和洗脫能力較好,最佳工藝條件為：上樣濃度5 mg/mL、上樣流速2 BV/h、上樣量4 BV、 洗脫流速2 BV/h、用30%乙醇溶液200 mL集中洗脫。經過純化后多糖的顏色變淺，多糖的含量從26.42%提高到71.29%，多糖回收率為49.52%。

龍膽草；多糖；純化；FL-3樹脂

龍膽草(GentianascabraBge)，又名地膽草﹑龍膽﹑草龍膽，藥用部分為龍膽科龍膽屬植物龍膽干燥的根和莖，是一種常用的中草藥。龍膽草在中國產地分布較廣，主要分布在貴州﹑云南﹑四川等地。黔產龍膽草主要分布在六枝，為黔西北道地藥材。龍膽草具有清熱燥濕﹑清肝瀉膽的作用[1]，有著廣泛的用途，如中成藥“龍膽瀉肝丸”就是以龍膽草為主要原料制成的[2]。研究發現龍膽湯對病毒性腦炎[3]、肝膽濕熱型帶狀皰疹[4]、突發性耳聾[5]、濕熱型帶下病[6]、單純皰疹性角膜炎的系統評價[7]、面癱[8]、宮頸炎合并Hpv[9]感染等疾病均有一定的療效。多糖為龍膽的有效成分之一[10-11]，試驗發現龍膽多糖有明顯的生理活性，具有抗腫瘤[12]﹑抗氧化[1]﹑抗凝血[13]﹑保肝﹑降血脂﹑調節免疫力[14]等作用，因此對龍膽草多糖的研究有一定的意義。

目前對龍膽多糖的研究主要是提取工藝，對龍膽多糖純化的研究較少。常見的分離純化方法是DEAE瓊脂糖凝膠法[15]﹑DEAE-cellulose DE-52離子交換層析法等[16]。但這些方法成本較高，價格昂貴。大孔樹脂法作為一種常見的分離純化的方法，因其具有吸附量較大、吸附速率快、價格便宜、可再生等優點，而被廣泛地應用于天然產物的分離和純化[17]。本試驗擬以黔產龍膽草為原料，提取龍膽多糖，并研究FL-3樹脂對龍膽多糖的吸附和洗脫，確定最佳純化的工藝條件，以期為龍膽多糖的工業化生產和進一步的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍膽草：購于貴州濟仁堂，產地為貴州六枝；

FL-3樹脂：鄭州勤實科技有限公司；

試驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

干燥箱：101-1A型，天津泰斯特公司；

電子天平：A 200S型，德國科恩公司；

循環水式多用真空泵：SHB-IIIA型，鄭州長城科工貿公司；

分光光度計：U V 2300型，上海天美科學儀器公司；

植物粉碎機：FZ 102型，天津市泰斯特公司。

1.3 方法

1.3.1 龍膽粗多糖的提取 參照文獻[18]，將龍膽草清洗﹑干燥并粉碎，按照料液比1∶30 (g/mL)加入蒸餾水，在80 ℃熱水中浸提2 h，離心(4 000 r/min)取上清液，將上清液80 ℃減壓濃縮至原體積的1/5，加入3倍體積的無水乙醇，靜置過夜，抽濾，依次用丙酮﹑無水乙醇洗滌沉淀，自然風干，得到龍膽草粗多糖。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制 參照文獻[19～20]，將葡萄糖標準品在105 ℃干燥至恒重，準確配制100 μg/mL的葡萄糖標準溶液。精確移取100 μg/mL葡萄糖溶液0.00，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL，分別置于7支比色管中，補水至1 mL，再加入5%的苯酚2.00 mL，混合均勻后迅速加入濃硫酸7.00 mL，搖勻后靜置10 min，放入沸水浴中20 min，冷至室溫，在490 nm下測吸光度，并繪制標準曲線(見圖1)。葡萄糖標準曲線的回歸方程：y=0.050 2x+0.023 5，相關系數R2=0.999 7，在0～10 μg/mL范圍內，濃度和吸光度呈現良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線Figure 1 Standard curve of glucose

1.3.3 FL-3樹脂的預處理 向FL-3樹脂中加入3倍體積的95%乙醇，浸泡24 h，再用蒸餾水洗滌樹脂至無乙醇味后，加入4%的NaOH浸泡2 h，用蒸餾水洗滌至中性，再用4%的HCl浸泡2 h，用蒸餾水洗滌至中性，并用蒸餾水浸泡以備用[21]。

1.3.4 上樣濃度對FL-3樹脂動態吸附的影響 將已處理好的FL-3樹脂等體積(30 cm3)分別裝入5根規格一樣的層析柱中，配制濃度分別2.000 0，3.000 0，4.000 0，5.000 0，6.000 0 mg/mL的多糖溶液各50 mL，以2 BV/h的流速分別上樣。充分吸附后收集流出液，測定流出液中多糖的含量，按式(1)計算吸附率[22]。

(1)

式中：

R1——吸附率，%；

c0——進樣液中多糖的濃度，mg/mL；

V0——進樣液的體積，mL；

c1——流出液中多糖的濃度，mg/mL；

V1——流出液的體積，mL。

1.3.5 上樣流速對FL-3樹脂動態吸附的影響 取5份濃度為5.138 0 mg/mL的多糖溶液，上樣量均為2 BV，分別以1，2，3，4，5 BV/h的流速通過裝有30 cm3FL-3樹脂的層析柱，充分吸附后收集流出液，測定流出液中多糖的含量，并計算吸附率。

1.3.6 上樣量對FL-3樹脂動態吸附的影響 配制5.445 0 mg/mL的多糖溶液，以2 BV/h的流速上樣，總上樣量為9 BV(270 mL)，并分別在上樣量為1，2，3，4，5，6，7，8，9 BV時測流出液中多糖的含量，并計算吸附率。

1.3.7 洗脫液濃度對洗脫效果的影響 將濃度為6.000 0 mg/mL的龍膽多糖溶液100 mL以2 BV/h的流速通過裝有30 cm3FL-3樹脂的層析柱，待吸附充分后，排凈樹脂間隙中的多糖溶液，再依次加入100 mL去離子水及10%，30%，50%，70%，90%的乙醇進行梯度洗脫，洗脫流速為2 BV/h，且每25 mL收集一次洗脫液。測定每瓶洗脫液中多糖的含量，并以瓶子編號為橫坐標，多糖含量為縱坐標做圖。按式(2)計算洗脫量。

Q=c3×V3，

(2)

式中：

Q——洗脫量，μg；

c3——洗脫液中多糖的濃度，μg/mL；

V3——洗脫液的體積，mL。

1.3.8 洗脫液用量對洗脫效果的影響 將50 mL濃度為5.000 0 mg/mL的龍膽多糖溶液以2 BV/h的流速通過層析柱，吸附充分后，先用蒸餾水將樹脂顆粒之間的間隙液沖走，再用30%乙醇溶液對樹脂進行洗脫，洗脫流速為2 BV/h，前100 mL流出液每隔5 mL檢測一次多糖含量，后400 mL每隔25 mL檢測一次流出液中多糖的含量，并以累積洗脫體積和多糖的含量為坐標繪制曲線。

1.3.9 洗脫流速對洗脫效果的影響 取5份濃度為5.340 0 mg/mL的多糖溶液，上樣量均為2 BV，均以1 BV/h的流速通過裝有30 cm3FL-3樹脂的層析柱，充分吸附后，用少量的蒸餾水洗滌樹脂，再用200 mL 30%的乙醇分別以1，2，3，4，5 BV/h的流速進行洗脫，并測定流出液中多糖的含量。

1.3.10 驗證性實驗 準確配制0.01 g/mL的粗多糖溶液再從中移取2.5 mL定容至100 mL，取1 mL稀釋液按照1.3.2的方法測吸光度，并按式(3)計算粗多糖的純度。

(3)

式中：

M——多糖純度，%；

C——稀釋后溶液的多糖濃度，μg/mL；

N——稀釋倍數；

V——多糖樣品液的總體積，mL；

W——粗多糖質量，g。

準確配制一定濃度的粗多糖溶液,以最佳的上樣流速通過樹脂柱，待充分吸附后，用200 mL的30%乙醇以2 BV/h的洗脫流速洗脫，并將洗脫液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥，測凍干多糖的純度，并按式(4)計算多糖回收率。

(4)

式中：

G——多糖回收率，%；

m1——提純多糖的質量，mg；

m2——粗多糖的質量，mg。

2 結果與討論

2.1 多糖的提取

按上述提取方法得到的龍膽草粗多糖為深棕色顆粒狀的固體，味道清香，在水中溶解效果較好，產率為4.5%。

2.2 上樣濃度對動態吸附率的影響

由圖2可知，上樣濃度對龍膽草多糖吸附率的影響較大，吸附率隨著上樣濃度的增大呈先升高后下降的趨勢，上樣濃度為5 mg/mL時吸附率最大。所以最佳上樣濃度為5 mg/mL，此時吸附率為85.57%。

圖2 上樣濃度對多糖吸附率的影響Figure 2 The effect of the concentration of polysaccharides on the absorption rate

2.3 上樣流速對動態吸附率的影響

由圖3可知，上樣流速越大，多糖的吸附率越小。如果多糖溶液上樣流速過快，多糖還沒來得及被樹脂吸附，就已經流出層析柱，會使吸附率減少；而如果流速較慢時，溶液中的多糖可以和樹脂充分接觸，吸附率較高，但如果流速過慢，會使過柱時間過長。由圖3可知，當流速為1 BV/h時，多糖的吸附率最高，但速率過慢，而2 BV/h的吸附率與其相差不大，所以選擇2 BV/h的上樣流速較為合適。

2.4 上樣量對動態吸附率的影響

由圖4可知，隨著上樣量的增大，多糖吸附率隨之降低，當上樣量>4 BV后，吸附率趨于穩定。說明上樣量到了一定程度，樹脂對多糖的吸附會達到飽和。雖然當上樣量為1 BV時，吸附率最高，但樹脂對多糖的吸附量較少(僅151.229 mg);而當上樣量為4 BV時，吸附率較低，但樹脂對多糖的吸附量較高(326.700 mg)。所以選4 BV為上樣量較為合適。

圖3 上樣流速對多糖吸附率的影響Figure 3 The effect of velocity on adsorption rate of polysaccharides

圖4 上樣量對多糖吸附率的影響Figure 4 The effect of sample size on adsorption rate of polysaccharide

2.5 洗脫液濃度的確定

由圖5可知，龍膽多糖的洗脫量主要集中在蒸餾水﹑10%乙醇和30%乙醇洗脫部分，其中最大洗脫峰出現在30%乙醇洗脫部分，30%乙醇部分的總洗脫量也最大且乙醇濃度升高，洗脫量變小。因此選擇用30%乙醇做洗脫液。

1～4號為水洗脫液；5～8號為10%乙醇洗脫液；9～12號為30%乙醇洗脫液；13～16號為50%乙醇洗脫液；17～20號為70%乙醇洗脫液；21～24為90%乙醇洗脫液

圖5 乙醇濃度對多糖洗脫量的影響

Figure 5 Different concentrations of ethanol elution volume

curve of polysaccharide

2.6 洗脫液用量的確定

由圖6可知，多糖的洗脫量主要集中在前200 mL的洗脫液中，當洗脫液的體積超過200 mL，再用30%乙醇繼續洗脫，多糖的量增加得很少，可以忽略，因此從經濟的角度出發，洗脫液的用量為200 mL時最佳。

2.7 洗脫流速的確定

由圖7可知，當洗脫量相同時，洗脫流速對洗脫量有一定的影響，流速加快，洗脫量減少，當流速為1 BV/h時，洗脫效果最好，但如果流速過慢，會使時間成本提高，考慮到洗脫流速為1 BV/h時，洗脫量與流速為2 BV/h時的洗脫量相差不大，所以選擇的合適的洗脫流速為2 BV/h。

2.8 驗證實驗

實驗測得提取的粗多糖純度為26.42%，經過樹脂純化后，多糖的純度提高到了71.29%，多糖回收率為49.52%。說明FL-3樹脂對龍膽多糖純化的效果較好。純化前的粗多糖顏色為深棕色，經過樹脂純化后，顏色變淺，為淺黃色的粉末，說明FL-3樹脂對多糖中的色素也具有一定的吸附和脫色功能。

圖6 洗脫液用量的考察曲線圖Figure 6 The dosage of eluent graph

圖7 洗脫流速對多糖洗脫量的影響Figure 7 The effect of elution flow rate on the elution of polysaccharide

3 結論

(1) 本試驗利用FL-3樹脂對龍膽草多糖進行提純，該樹脂對龍膽草多糖具有較好的分離純化效果，提純后多糖的顏色變淺，純度也從26.42%提高到了71.29%，多糖回收率為49.52%。

(2) 通過對FL-3樹脂進行動態工藝參數研究，得出最佳的純化工藝條件為:上樣濃度5 mg/mL，上樣流速2 BV/h，上樣量4 BV，用200 mL 30%乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h。

(3) 本試驗僅對FL-3樹脂純化龍膽多糖的工藝進行研究，今后還應該進一步深入研究如何提高龍膽的純度。此外，用該工藝純化后是否會影響其生物活性尚未可知，因此在后續的試驗中可對提純前后多糖的抗氧化和抑菌活性進行深入研究。

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Optimization on adsorption and purification process for gentian polysaccharide in Guizhou by macroporous resin

GONGJiang-ning

RAOYu

YANGYi-ju

CHENFei

(SchoolofChemistryandMaterialScience,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

The content of polysaccharide was determined by phenol sulfuric acid method. The research investigated FL-3 resin on the adsorption and desorption effect ofGentianascabraBungepolysaccharide. FL-3 resin was used to purify the polysaccharide. Using the adsorption rate and desorption amount of polysaccharide as the index, the FL-3 resin purification process of polysaccharide was studied. The optimum conditions for the adsorption and resolution of polysaccharide by FL-3 resin were obtained. The experimental results showed that the polysaccharide can be effectively adsorbed and desorbed by the FL-3 resin. The optimum purification conditions were as follows: the sample concentration was 5 mg/mL, the sample flow rate was 2 BV/h, the sample volume was 4 BV, the elution flow rate was about 2 BV/h, and the concentration of ethanol solution was 30%，the elution volume was 200 mL. After purification, the color of polysaccharide become shallow, and the content of that was increased from 26.42% to 71.29%.The recovery rate of polysaccharide was 49.52%.

GentianascabraBunge; Polysaccharide; Purification; FL-3 macroporous resin

貴州省科技廳2012年度貴州省科技廳與貴州師范大學聯合基金計劃項目(編號：黔科合J字LKS[2012]17號)

宮江寧(1979—)，女，貴州師范大學副教授，碩士。 E-mail:9121555@qq.com

2017—03—12

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.036