貓兒屎內(nèi)生真菌DL06次生代謝產(chǎn)物及抑菌活性的研究

楊秀芳， 龍園園， 許 倩， 馬養(yǎng)民

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710021)

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貓兒屎內(nèi)生真菌DL06次生代謝產(chǎn)物及抑菌活性的研究

楊秀芳， 龍園園， 許 倩， 馬養(yǎng)民*

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710021)

從貓兒屎內(nèi)生真菌產(chǎn)黃青霉DL06發(fā)酵物中分離出15個(gè)化合物，通過(guò)波譜數(shù)據(jù)、理化性質(zhì)鑒定化合物結(jié)構(gòu).在原分離鑒定的基礎(chǔ)上又分離鑒定出了7 個(gè)化合物，分別為2-乙酰基-4(3H)-喹唑啉酮(9)、煙酸(10)、meleagrin(11)、赤蘚醇(12)、富馬酰-L-丙氨酸(13)、胡蘿卜苷(14)、甘露醇(15).并對(duì)分離出的7個(gè)化合物的抑菌活性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明：化合物9、10、11、13對(duì)測(cè)試菌有不同程度的抑制作用.

貓兒屎； 內(nèi)生真菌； 代謝產(chǎn)物； 化學(xué)成分； 抑菌活性

0 引言

貓兒屎(Decaisneafargesii)，系木通科(Lardiyabalaeeae)，屬落葉灌木[1].主要分布于安徽、湖北、甘肅、浙江、湖南及西南等省區(qū)，陜西秦巴山區(qū)也具有極為豐富的貓兒屎野生資源[2].其根和果可藥用，具有清熱解毒功效，可用于治療肺癆咳嗽，風(fēng)濕痹痛[3].

目前,對(duì)貓兒屎的研究?jī)H限孔杰[4]從貓兒屎植物的莖中分離并鑒定了10個(gè)皂苷化合物.而對(duì)貓兒屎內(nèi)生真菌的研究?jī)H限于本課題組，王鵬飛等[5]從秦巴山區(qū)貓兒屎的根、莖、葉中分離到內(nèi)生真菌91株，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定這91株內(nèi)生真菌分屬于6目7科15屬，通過(guò)活性測(cè)試，得到4株強(qiáng)活性菌種DS37、DS58、DL06和DL14.張影珍等[6]、楊秀芳等[7]從DS58中共分離并鑒定了14個(gè)化合物，同時(shí)對(duì)其生物活性進(jìn)行研究報(bào)道.

本研究以DL06為目標(biāo)菌株，對(duì)DL06菌株進(jìn)行ITS序列測(cè)定，最終將DL06菌株鑒定為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)，Genbank登錄號(hào)為KP690795[8].并對(duì)貓兒屎內(nèi)生真菌DL06的次生代謝產(chǎn)物化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，共分離得到15個(gè)化合物，其中8個(gè)化合物已由許倩等在參考文獻(xiàn)[8]中進(jìn)行報(bào)道.本文則對(duì)后續(xù)分離得到的7個(gè)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其生物活性進(jìn)行了測(cè)試.

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株DL06自秦巴山區(qū)貓兒屎植物的葉分離得到，以PDA斜面培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后4 ℃保存至實(shí)驗(yàn)室(課題組).4株細(xì)菌：金黃色葡萄球菌，乳鏈球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌，10株植物病原真菌：蘋果樹(shù)腐爛病菌，油菜菌核病菌，葡萄炭疽病菌，小麥赤霉病菌，白菜黑斑病菌，番茄灰霉病菌，辣椒疫霉病菌，芍藥炭疽病菌，玉米大斑病菌，煙草赤星病菌保存于實(shí)驗(yàn)室.

1.2 儀器、培養(yǎng)基

1.2.1 主要儀器

DH5000B電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；ZHJH-C11098型超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；YX-280B手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；XSP-C240COIC雙目光顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)； ZF5手提式紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；HZQ-Q全溫振蕩器(金壇市瑞華儀器廠)；Bruker avance III-400MHz 超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；Bruker-maXis-4GUHR-TOF HRESI-MS(德國(guó)布魯克公司)；EV311 型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(北京萊伯特科儀器有限公司)； HF2000型酶標(biāo)儀(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)；3590costar96孔酶標(biāo)板(美國(guó)Corning Costar公司).

1.2.2 培養(yǎng)基

(1)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，121 ℃高溫滅菌25 min.

(2)馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯浸出液200 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，121 ℃高溫滅菌25 min.

1.3 次生代謝產(chǎn)物的分離和純化

將風(fēng)干的固體發(fā)酵物用乙酸乙酯萃取6次，減壓濃縮得150 g.經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫，得到9個(gè)組分(Fr.1-Fr.9)，從Fr.3得到化合物9(8 mg)、Fr.7中得到化合物10(17 mg)、從Fr9得到化合物11(15 mg)、12(150 mg)、從Fr.6得到化合物13(31 mg)、從Fr.8得到化合物14(70 mg)，從甲醇相得到化合物15(231 mg).

1.4 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

所有化合物經(jīng)1H-NMR 、13C-NMR和ESI-MS 解析，結(jié)合文獻(xiàn)，確定其結(jié)構(gòu).

1.5 抗菌活性測(cè)定

對(duì)貓兒屎內(nèi)生真菌DL06次生代謝產(chǎn)物分離得到的7個(gè)化合物的抑菌活性進(jìn)行測(cè)試.分別選取金黃色葡萄球菌，乳鏈球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌，10株植物病原真菌蘋果樹(shù)腐爛病菌，油菜菌核病菌，葡萄炭疽病菌，小麥赤霉病菌，白菜黑斑病菌，番茄灰霉病菌，辣椒疫霉病菌，芍藥炭疽病菌，玉米大斑病菌，煙草赤星病菌作為測(cè)試菌，采用最小抑菌濃度法對(duì)各化合物的抑菌活性進(jìn)行測(cè)試，具體操作方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9].

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株DL06代謝產(chǎn)物

從菌株DL06固體發(fā)酵物中共分離得到15個(gè)化合物，其中化合物1～8的結(jié)構(gòu)解析已作報(bào)道，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]，下面就另外7個(gè)化合物結(jié)構(gòu)解析如下.

化合物9：淡黃色晶體(甲醇)，mp.185 ℃～187 ℃.HRESI-MS：m/z，211.047 0 [M+Na]+，表明化合物分子量為188.058 6，推測(cè)分子式為C10H8N2O2，不飽和度為8.1H-NMR(400 MHz,DMSO)δ(ppm)：12.30(1H,br s,-NH-)，8.21(1H,d,J=7.76 Hz,10-H),7.92(1H，m,8-H)，7.87(1H,m,7-H)，7.66(1H,t,J=7.4,14.8Hz,9-H)，2.64(3H,s，2，-H)；13C-NMR(100 MHz,DMSO)δ(ppm)：193.95(1，-CO-)，160.82(4-CO-)，147.36(C-6)， 147.18(C-2)，134.75(C-8)128.84(C-9)，128.47(C-7)，126.13(C-10)123.14(C-5)， 24.74(C-2，)，結(jié)合DEPT-135和HSQC 并與文獻(xiàn)[10,11]對(duì)比，確定化合物9為2-乙?；?4(3H)-喹唑啉酮，結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

圖1 化合物9的結(jié)構(gòu)

化合物10：淡黃色粉末(甲醇)，mp.232 ℃～234 ℃.1H-NMR(400 MHz,DMSO)δ(ppm)：9.06(1H,s,2-H)， 8.78(1H,d,J=3.92 Hz，6-H)，8.28(1H,d,J=7.76 Hz，4-H)，7.56(1H,dd,J=4.8 Hz,7.3 Hz，5-H)；13C-NMR(100 MHz,DMSO)δ(ppm)：166.3(-COOH)，153.22(C-6)，150.08(C-2)，137.03(C-4)，123.88(C-5)， 126.54(C-3))，根據(jù)文獻(xiàn)[12]，結(jié)合DEPT-135，確定化合物10為煙酸，結(jié)構(gòu)式如圖2所示.

圖2 化合物10的結(jié)構(gòu)

化合物11：紅色粉末(甲醇)，生物堿顯色劑顯色為黃色，mp.251 ℃～252 ℃.HRESI-MS：m/z，[M+H]+=434.183，[M+Na]+=456.165 6，推測(cè)分子式為C23H23N5O4.1H-NMR(400 MHz,DMSO)δ(ppm)： 9.94(1H,br s,17-NH)， 9.57(1H,br s,14-NH)，8.14(1H,s,15-H)，7.78(1H,s,20-H)，7.53(1H,d,J=7.68 Hz,4-H)，7.48(1H,br s,18-H)，7.25(1H,t,J=7.66 Hz,6-H)，7.04(1H,t,J=7.58 Hz,5-H)，6.97(1H,d,J=7.76 Hz,7-H)，5.94(1H,br s,22-H)，5.28(1H,s,8-H) ，4.94(2H,m,23-H)，3.62(3H,s,1-OCH3)，1.16(6H，m,24-H)；13C-NMR(100 MHz,DMSO)δ(ppm)： 164.78(13-CO-)，158.60(10-CO-)，146.01(C-7a)，142.89(C-9)，142.46(C-22)，137.19(C-20)，130.91(C-18)，128.15(C-6)，125.57(C-16，C-3a)，124.67(C-4)，123.96(C-12)，123.37(C-5)，111.52(C-7)，112.95(C-23)，109.39(C-8)、107.70(C-15)，101.12(C-2)，64.67(1-OCH3)，52.20(C-3)，41.70(C-21) ，26.23(C-24)，結(jié)合DEPT-135、HMBC、1H-1H COSY，化合物11的理化性質(zhì)和核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13,14]中meleagrin基本吻合，故確定化合物11為meleagrin，結(jié)構(gòu)式如圖3所示.

圖3 化合物11的結(jié)構(gòu)

化合物12：無(wú)色晶體(甲醇)，mp.122 ℃～124 ℃.1H-NMR (400 MHz,DMSO)δ(ppm)： 4.44(2H,s,1,4-OH)，4.32(2H,s,2,3-OH)， 3.54(2H,m,2,3-H)， 3.37(4H,m,2,3-H)；13C-NMR (100 MHz,DMSO)δ(ppm)： 72.51(C-2,3)，63.28(C-1,4)，結(jié)合核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)比，確定化合物12為赤蘚醇，其結(jié)構(gòu)式如圖4所示.

圖4 化合物12的結(jié)構(gòu)

化合物13：白色粉末(甲醇)，mp.226 ℃～228 ℃.HRESI-MS：m/z， [M+Na]+=210.037 3，推測(cè)分子式為C7H9NO5.1H-NMR (400 MHz,DMSO)δ(ppm)： 12.81(2H,br s,-COOH)， 8.85(1H,d,J=7.2 Hz,-NH-)， 7.01(1H,d,J=15.5 Hz,3-H)，6.55(1H,d,J=15.5 Hz,1-COOH)，4.29(1H，m-CH-)， 1.32(3H,d,J=7.3 Hz,-CH3)；13C-NMR (100 MHz,DMSO)δ(ppm)： 173.67(-COOH)，166.35(1-COOH)，162.75(C-4)， 136.43(C-3)，130.04(C-2)， 47.87(-CH-)， 17.03(-CH3).結(jié)合DEPT-135、HSQC、HMBC，并與文獻(xiàn)[16]對(duì)比，確定化合物13為富馬酰-L-丙氨酸，其結(jié)構(gòu)如圖5所示.

圖5 化合物13的結(jié)構(gòu)

化合物14：白色粉末，微溶于甲醇，mp.291 ℃～293 ℃.1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：5.34(1H,s,6-H)，4.46(1H,t,J=5.7 Hz,3-H，4.22(1H,d,J=7.8 Hz,1,-H)；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ(ppm)：140.40(C-5)，121.09(C-6)，100.73(C-1,)，76.87(C-3,)，76.72(C-3)，76.66(C-5,)、73.41(C-2,)、70.08(C-4,)61.04(C-6,)，56.10(C-14)，55.37(C-17)，49.54(C-9)，45.09(C-24)，40.50(C-4)，41.78(C-13,C-16)，38.25(C-1)，36.75(C-23)，36.14(C-20)，35.38(C-22)，33.29(C-7)，31.35(C-8)，29.19(C-2)，28.67(C-25)，27.68(C-12)，25.44(C-10)，23.77(C-15)，22.54(C-28)，20.51(C-11)19.61(C-27)，19.01(C-19)，18.87(C-21)，18.53(C-26)，11.70(C-29)，11.59(C-18).結(jié)合DEPT-135、HSQC解析及核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17，18]對(duì)比，故確定化合物14為胡蘿卜苷，結(jié)構(gòu)式如圖6所示.

圖6 化合物14的結(jié)構(gòu)

化合物15：白色晶體(甲醇)，mp.163 ℃～165 ℃.1H-NMR (400 MHz,DMSO)δ(ppm)：4.41(2H,d,J=5.5 Hz,2,5-OH)，4.32(2H,t,J=5.7 Hz,1,6-OH)，4.14(2H,d,J=7.1 Hz,3,4-OH)， 3.64(2H,m,2,5-H)，3.54(2H,t,J=7.6 Hz,3,4-H)，3.46(4H,m,1,6-H)；13C-NMR (100 MHz,DMSO)δ(ppm)：71.3(C-3,4)，69.7(C-2,5)，63.8(C-1,6).與文獻(xiàn)[19]中的核磁數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物15為甘露醇，結(jié)構(gòu)如圖7所示.

圖7 化合物15的結(jié)構(gòu)

2.2 化合物抑菌活性

從菌株DL06發(fā)酵產(chǎn)物后續(xù)分離得到的7個(gè)化合物抑菌活性測(cè)試結(jié)果如表1、表2所示.

由表1可知，化合物9、10、11、13對(duì)細(xì)菌有不同程度的抑制作用，其中化合物9對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑制作用，化合物10、11、13對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抑制作用.

由表2 可知，在抑制植物病原真菌測(cè)試結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：化合物9、10、11、13對(duì)真菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性.其中化合物11對(duì)真菌均具有很強(qiáng)的抑制作用，其抑菌效果基本與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)，化合物9、13對(duì)大部分真菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性.

表1 化合物對(duì)細(xì)菌抑菌活性測(cè)試結(jié)果

注：“-”表示未設(shè)置.

表2 化合物對(duì)植物病原菌的抑菌活性測(cè)試結(jié)果

注：植物病原真菌：A-蘋果樹(shù)腐爛病菌，B-油菜菌核病菌，C-葡萄炭疽病菌，D-小麥赤霉病菌，E-白菜黑斑病菌，F(xiàn)-番茄灰霉病菌，G-辣椒疫霉病菌，H-芍藥炭疽病菌，I-玉米大斑病菌，J-煙草赤星病菌.

3 結(jié)論

(1) 對(duì)貓兒屎內(nèi)生真菌DL06發(fā)酵產(chǎn)物分離得到的15個(gè)化合物按結(jié)構(gòu)分類，其主要包含甾體類(1，14)、異香豆素類(2)、酮類(3)、醌類(4)、生物堿類(9，10，11，13)、有機(jī)酸類(5，6，8)等化合物，由此可知貓兒屎內(nèi)生真菌DL06次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分種類豐富.

(2)抑菌活性顯示菌株DL06能產(chǎn)生具有廣譜抑菌作用的化合物，也可產(chǎn)生具有選擇性抑菌作用的化合物.

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【責(zé)任編輯：陳 佳】

Study on antimicrobial activity and the secondary metabolites of endophytic fungi DL06 fromDecaisneafargesii

YANG Xiu-fang， LONG Yuan-yuan， XU Qian， MA Yang-min*

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry, Ministry of Education, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Fourteen known compounds had been isolated from theAspergillus.nigerDL06 ofDecaisneafargesii.Their structures were identified by spectra and physicochemical properties analysis.Seven compounds were obtained and identified as 2-acetyl-4(3H)-quinazolinone (9),nicotinic acid (10),meleagrin (11),erythritol(12),fumaryl-L-alanine (13),daucosterol(14) and mannitol(14).The antimicrobial activity test of these 7 compounds' showed that Compounds 9,10,11 and13 had good antibacterial activities against most of test bacteria.

Decaisneafargesii； endophytic fungi； metabolites； chemical constituents； antimicrobial activity

2017-03-08

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014JZ003)

楊秀芳(1963-)，女，陜西銅川人,教授，研究方向:天然產(chǎn)物加工

馬養(yǎng)民(1963-)，男，陜西乾縣人,教授，博士，研究方向:天然有機(jī)化合物，mayangmin@sust.edu.cn

2096-398X(2017)04-0138-04

TQ041+.7

A