HHIP基因多態(tài)性與新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性的關系研究

成芳娟，關 鍵，任 俠，馬程遠

·論著·

HHIP基因多態(tài)性與新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性的關系研究

成芳娟，關 鍵*，任 俠，馬程遠

目的 探討HHIP基因rs13118928、rs1828591位點單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性的關系。方法 選取2014年10月—2016年5月在伊犁州友誼醫(yī)院、新華醫(yī)院、石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸科住院及門診就診的COPD患者214例為病例組。另選取同期在這幾家醫(yī)院進行體檢的健康者350例為對照組。統(tǒng)一使用美國Medgraphics公司的肺功能儀進行用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣末容積(FEV1)測定，并記錄FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC。所有受試者抽取外周靜脈血標本，提取標本DNA，運用imLDRTM多重SNP分型技術檢測HHIP基因各位點的多態(tài)性。結果 兩組rs13118928位點基因型及等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組rs1828591位點基因型及等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例組rs13118928位點不同基因型患者FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例組rs1828591位點不同基因型患者FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組HHIP基因rs13118928、rs1828591兩位點單體型分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 HHIP基因rs13118928、rs1828591位點SNPs與新疆哈薩克族COPD易感性無明顯關系。

肺疾病,慢性阻塞性；HHIP基因；多態(tài)性,單核苷酸

成芳娟，關鍵，任俠，等.HHIP基因多態(tài)性與新疆哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性的關系研究[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(19)：2378-2382.[www.chinagp.net]

CHENG F J,GUAN J,REN X,et al.Relationship between HHIP gene polymorphism and chronic obstructive pulmonary disease susceptibility in Kazakh population in Xinjiang,China[J].Chinese General Practice，2017，20(19)：2378-2382.

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的以持續(xù)性氣流受限為特征且氣流受限呈進行性發(fā)展的復雜性疾病。目前COPD的發(fā)病機制尚不完全明了，可能與吸煙及遺傳等因素有關。一項全基因組關聯(lián)研究(GWAS)薈萃分析研究了20 890例歐洲人的外周血等位基因型，發(fā)現(xiàn)包括HHIP在內的8個基因和第1秒用力呼氣末容積(FEV1)與用力肺活量(FVC)比值有關[1]。一項對挪威823例COPD患者及 810 例吸煙者的對照分析發(fā)現(xiàn)，HHIP基因與FEV1/FVC相關，可能是COPD重要風險基因[2]。本研究旨在探討中國新疆地區(qū)哈薩克族HHIP基因 rs13118928、rs1828591位點與COPD的易感性的關系，以期從分子水平探究基因遺傳對新疆地區(qū)哈薩克族COPD病程進展的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年10月—2016年5月在伊犁州友誼醫(yī)院、新華醫(yī)院、石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸科住院及門診就診的COPD患者214例為病例組。診斷標準：均符合2015年COPD診斷、治療和預防的全球戰(zhàn)略中的診斷標準[3]，即凡具有吸煙史和/或環(huán)境職業(yè)污染及生物燃料接觸史，臨床上有呼吸困難或咳嗽、咳痰病史，進行肺功能檢查，吸入支氣管擴張劑后FEV1/FVC<70%，可確診為 COPD。排除標準：支氣管哮喘、支氣管擴張等其他肺部疾病和胸部手術病史。另選取同期在這幾家醫(yī)院進行體檢的健康者350例為對照組。本研究經(jīng)石河子大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，受試者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 記錄受試者的性別、年齡，測量身高、體質量，詢問吸煙情況。

1.2.2 肺功能檢測 統(tǒng)一使用美國Medgraphics公司的肺功能儀進行測定，具體步驟如下：(1)將受試者年齡、性別、身高、體質量輸入自行編制的軟件(參考值公式參考穆魁津等[4]主編的全國肺功能正常值匯編)，得到受試者肺功能值；(2)受試者取立位，試驗前休息5 min，由操作人員說明此項檢查的做法，并做示范動作；(3)帶鼻夾，通過一次性口器與肺功能儀連接，囑患者于用力吸氣至最大肺容量，然后用力呼出至功能殘氣位，呼氣時間不得少于4 s；(4)重復3次，選取FVC和FEV1之和最大的1次記錄結果；(5)通過肺功能檢查儀記錄FVC、FEV1、FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC；(6)若受試者FEV1/FVC<70%，行支氣管舒張試驗，步驟如下：①患者休息30 min，進行首次肺功能檢測；②吸入沙丁胺醇4噴(400 μg)；③休息15 min后再次行肺功能檢查，步驟同上；④計算FEV1改善的絕對值和改善率。所有操作人員經(jīng)過統(tǒng)一培訓。

本文要點：

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)病機制尚不完全明確，相關基因研究表明HHIP基因與第1秒用力呼氣末容積與用力肺活量比值(FEV1/FVC)有關，可能是COPD的重要風險基因。國內外多項研究結果顯示，HHIP基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與COPD易感性及其肺功能相關，但關聯(lián)的SNPs不盡相同，且同一位點與不同人群COPD 的關系也未達成統(tǒng)一。本研究探討了中國新疆地區(qū)哈薩克族HHIP基因rs13118928、rs1828591位點與COPD易感性的關系，結果未發(fā)現(xiàn)HHIP基因rs13118928、rs1828591位點多態(tài)性及單體型與 COPD有關，接下來將進一步完善HHIP基因其他位點與哈薩克族COPD易感性的研究并構建其完善的基因體系。

1.2.3 DNA的提取 抽取所有受試者的外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用北京 TIANGEN 生化科技公司提供的離心柱型試劑盒提取血液基因組DNA，并于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆茫\用超微量分光光度計對DNA純度及濃度進行檢測。

1.2.4 rs13118928、rs1828591位點多態(tài)性的測試 采用imLDRTM多重SNP分型技術進行rs13118928、rs1828591位點多態(tài)性檢測。

1.2.4.1 DNA樣本質控 DNA樣本取1 μl 1%瓊脂糖凝膠電泳對其樣本進行質量檢查以及濃度估計，然后根據(jù)估計的濃度將樣本稀釋到工作濃度5～10 ng/μl。

1.2.4.2 多重PCR反應 (1)引物設計：rs13118928位點引物序列為：F:5′ -TTTCTGAGCAGGGAGGGCATCT -3′；R:5′-GGAATTTCTCACAGTGCACACAGG -3′；rs1828591位點引物序列為：F:5′-CTGTGCGTCATTCTTCCCATGT-3′；R:5′-CCCCCAAATTCATGCCTTTTTC -3′。(2)反應條件：反應體系(10 μl)包含1x GC-I buffer(Takara.),3.0 mM鎂離子(Mg2+),0.3 mM脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP),1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA和1 μl多重PCR引物。(3)PCR 循環(huán)程序：首先95 ℃ 2 min，然后循環(huán)11次以下過程，94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，每次循環(huán)降低 0.5 ℃，72 ℃ 1.5 min；最后 94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán) 24 次；72 ℃ 2 min，在 4 ℃條件下保存。取擴增產物 1.5 μl制膠后進行電泳檢測，若有目的片段則驗證擴增成功。

1.2.4.3 多重PCR產物純化 在10 μl PCR產物中加入5 U 蝦堿酶(SAP酶)和 2 U 外切核酸酶(Exonuclease I酶)，37 ℃溫浴1 h,然后75 ℃滅活15 min。

1.2.4.4 連接反應 (1)反應引物：rs13118928位點，RA:5′-TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTTGCACTTTGGAACCAACTGAATCAT-3′；RG:5′-TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTTGCACTTTGGAACCAACTGAATCAC-3′；RP:5′-AGACAATCAATGTGGAATATTGTTTCTGT-3′；rs1828591位點，F(xiàn)A:5′-TACGGTTATTCGGGCTCCTGTGGGTAATCCAGTGGAGAAGTAAAAGGAA-3′；FG:5′-TTCCGCGTTCGGACTGATATGGGTAATCCAGTGGAGAAGTAAAAGAAG-3′；FP:5′-GATGGAATGGAAGAGAC TATGAAAAAGG-3′。(2)反應體系：10×連接緩沖液 1 μl、高溫連接酶 0.25 μl、5′連接引物混合液(1 μM)0.4 μl，3′連接引物混合液(2 μM)0.4 μl、純化后多重PCR產物 2 μl、雙蒸水(ddH2O)6 μl 混勻。(3)反應程序：循環(huán)38次以下過程，94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min；4 ℃永久保存。

1.2.4.5 連接產物上ABI3730XL測序儀 取0.5 μl 稀釋后的連接產物，與0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD，9 μl Hi-Di混勻，95 ℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀。運用GeneMapper 4.1(Appliedbiosystems)軟件對本試驗結果進行分析。

2 結果

2.1 兩組基本資料比較 兩組性別、年齡、每日吸煙量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 遺傳平衡相關度檢驗rs13118928、rs1828591位點SNP分型結果顯示，病例組214個樣本，rs13118928位點一個樣本分型失敗，rs1828591位點全部分型成功；對照組350個樣本，兩位點全部分型成功。病例組和對照組中HHIP基因rs13118928位點(χ2值分別為0.479、0.494，P值分別為1.000、0.456)、rs1828591位點(χ2值分別為0.472、0.493，P值分別為1.000、0.394)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

2.3 兩組rs13118928、rs1828591位點基因型及等位基因分布比較 兩組rs13118928位點基因型及等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。兩組rs1828591位點基因型及等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

表1 兩組基本資料比較

Table1Baselinecharacteristicsofthecontrolgroupcomparedwiththoseofthecasegroup

組別例數(shù)男/女年齡(x±s,歲)每日吸煙量(x±s,支/d)FEV1占預計值百分比(x±s,%)FEV1/FVC(x±s,%)對照組350293/5760.6±10.519.2±11.288.1±9.886.3±6.7病例組214189/2561.1±10.920.6±12.056.6±10.859.1±5.4t(χ2)值2.265a0.5570.69219.95019.389P值0.1320.5780.490<0.001<0.001

注：a為χ2值；FEV1=第1秒用力呼氣末容積，F(xiàn)VC=用力肺活量

表2 兩組rs13118928位點基因型及等位基因分布比較〔n(%)〕

注：- 代表以AA為參照

表3 兩組rs1828591位點基因型及等位基因分布比較〔n(%)〕

注：- 代表以AA為參照

2.4 病例組rs13118928、rs1828591位點不同基因型患者肺功能指標比較 病例組rs13118928位點不同基因型患者FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表4)。病例組rs1828591位點不同基因型患者FEV1占預計值百分比、FEV1/FVC比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表5)。

2.5 兩組HHIP基因兩位點單體型分布比較 使用Phase軟件對HHIP基因rs13118928、rs1828591位點單體型進行推斷，共2種單體型形成，即Hap1(AA)、Hap2(GG)，兩組HHIP基因兩位點單體型分布比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表6)。

Table 4 FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio between patients in the case group by rs13118928 genotypes

基因型例數(shù)FEV1占預計值百分比FEV1/FVCAA 58 54.6±9.858.6±5.8GA10657.8±10.959.4±5.5GG 49 56.3±11.858.9±4.9F值1.6920.413P值0.1720.710

Table 5 FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio between patients in the case group by rs1828591 genotypes

基因型例數(shù)FEV1占預計值百分比FEV1/FVCAA 60 54.5±9.758.6±5.7GA10657.8±10.959.4±5.5GG 48 56.5±11.858.9±4.9F值1.8100.392P值0.1530.720

3 討論

HHIP是一種細胞膜蛋白可直接結合音猬因子(SHH)、印度刺猬(Ihh)和沙漠刺猬(DHH)3種配體，這些配體通過結合膜受體PTCH1從而啟動刺猬信號通路。HHIP通過與PTCH1競爭刺猬配體的結合，負向調節(jié)刺猬蛋白通路，是肺等器官發(fā)展的一個重要途徑[5-7]。Hh信號通路的活化在一些成體組織的修復、再生過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。而反復氣道炎癥所致的氣管壁損傷-修復，進而引起氣管結構重塑、管腔狹窄、氣流受限是COPD 的主要病理基礎。盡管COPD的GWAS提供了位于染色體4q31的HHIP基因與COPD 易感性令人信服的證據(jù)[9-10]，但其在COPD 發(fā)病中的作用機制尚不明確。

表6 兩組HHIP基因2位點單體型分布比較〔n(%)〕

Table 6 Patterns of haplotype frequencies for rs13118928 and rs1828591 at the HHIP locus in the case group and control group

組別Hap1Hap2對照組346(49.4)353(50.4)病例組222(52.1)202(47.4)χ2值0.8630.863P值0.3520.352OR(95%CI)1.121(0.881,1.427)0.892(0.701,1.135)

一項GWAS研究表明,HHIP基因附近的單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)rs1828591、rs13118928 與COPD的風險有關，驗證了HHIP基因附近的遺傳變異與COPD易感性的關系。兩個SNPs與COPD的風險明顯相關，其中G等位基因純合性導致COPD降低40%，并進一步說明了 rs13118928和rs1828591與COPD、肺功能明顯有關[9，11]。于2011年ZHOU等[12]在波蘭高加索研究人口中，確認了rs13118928 SNPs在同樣的基因組區(qū)域與重度及極重度的COPD相關聯(lián)，而且與中度COPD相比可能受到遺傳因素很大的影響。2013年KIM等[13]對韓國139例COPD和199例吸煙健康者的研究發(fā)現(xiàn)HHIP附近兩個SNPs (rs11938704和rs10013495)與COPD的FEV1明顯相關，同時在KOLD隊列研究中顯示該SNPs與COPD的易感性無明顯相關，但與其使用支氣管舒張劑前后的FEV1明顯相關[13]。隨后 WANG等[14]調查了中國漢族人群中HHIP多態(tài)性與COPD易感性和COPD 相關表型的關系，發(fā)現(xiàn)rs12504628與FEV1/FVC相關，rs10519717與COPD的嚴重程度有關。但未發(fā)現(xiàn)SNP rs13118928、rs1828592兩位點與漢族COPD 易感性有明顯相關。國內外多項群體HHIP基因SNPs關聯(lián)研究(非亞洲人、韓國人、中國漢族人等群體的各項研究)均顯示HHIP基因SNPs多態(tài)性與COPD易感性及其肺功能相關，但關聯(lián)的SNPs不盡相同，且同一位點與不同人群COPD 的關系也未達成統(tǒng)一[9,11-14]。

目前關于HHIP基因多態(tài)性與新疆哈薩克族COPD易感性關系的研究尚罕見報道。本研究對新疆哈薩克族COPD與HHIP基因rs13118928、rs1828591位點間的關系進行探討，未發(fā)現(xiàn)HHIP基因rs13118928、rs1828591位點多態(tài)性及單體型與 COPD有關。HHIP基因單核苷酸位點較多，在不同地域、種族的人群與COPD相關的SNP不盡相同。此次研究只分析了其中兩個位點，新疆哈薩克族人群COPD與其他位點的關系尚不清楚。HHIP基因不同位點間存在連鎖不平衡，且COPD 的發(fā)病機制較為復雜，因此其在COPD 發(fā)病中起關鍵作用的位點不易確定，需進一步完善HHIP基因其他位點與哈薩克族COPD易感性的研究并構建其完善的基因體系。

作者貢獻：成芳娟進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計學處理、結果的分析與解釋、撰寫論文、中英文修訂；關鍵進行研究的實施與可行性分析、中英文修訂，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理；任俠進行研究的實施與可行性分析、進行數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計學處理；馬程遠進行數(shù)據(jù)收集。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔沙沙)

Relationship between HHIP Gene Polymorphism and Chronic Obstructive Pulmonary Disease Susceptibility in Kazakh Population in Xinjiang,China

CHENGFang-juan,GUANJian*,RENXia,MACheng-yuan

No.2DepartmentofRespiratoryMedicine，theFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege，ShiheziUniversity，Shihezi832008，China

*Correspondingauthor:GUANJian,Chiefphysician，Professor，Mastersupervisor;E-mail:guanjian6@163.com

Objective To explore the relationship of two single nucleotide polymorphisms(SNPs),rs13118928 and rs1828591,of HHIP gene with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) susceptibility in Kazakh population in Xinjiang,China.Methods The participants enrolled were 214 inpatients and outpatients(case group) who

treatment of department of respiratory medicine,and 350 healthy controls(control group) underwent physical examination,in Ili Kazak Autonomous Prefecture Friendship Hospital,Xinhua Hospital,and the First Affiliated Hospital of the Medical College，Shihezi University from October 2014 to May 2016.Pulmonary function measurement apparatus produced by an American company,Medgraphics Corp.was used to measure the forced vital capacity(FVC),forced expiratory volume in one second (FEV1),FEV1% predicted,and FEV1/FVC ratio.The imLDRTMtechnique for SNP genotyping was used to detect the polymorphisms of HHIP gene in peripheral venous blood cells.Results The patterns of genotype and allele frequencies of rs13118928 at the HHIP locus did not differ significantly between the groups(P>0.05).The patterns of genotype and allele frequencies of rs1828591 at the HHIP locus in the case group were not obviously different from those of in the control group(P>0.05).FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio did not differ substantially between the patients in the case group by rs13118928 genotypes(P>0.05).No differences in FEV1% predicted and FEV1/FVC ratio were found between the patients in the case group by rs1828591 genotypes(P>0.05).The groups did not display notable differences in the patterns of haplotype frequencies for rs13118928 and rs1828591 at the HHIP locus(P>0.05).Conclusion The two SNPs (rs13118928 and rs1828591) at the HHIP gene locus have no significant correlation with COPD susceptibility in Kazakh population in Xinjiang,China.

Pulmonary disease,chronic obstructive;HHIP gene;Polymorphism,single nucleotide

國家自然科學基金資助項目(81560009)

R 563

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.19.016

2017-02-12；

2017-05-10)

832008新疆維吾爾自治區(qū)石河子市，石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸二科

*通信作者：關鍵，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師；E-mail：guanjian6@163.com