基于血清藥物化學和血清藥理學研究麻黃附子細辛湯抗炎和免疫抑制的物質基礎

李媛　李貞

[摘要]目的：探討麻黃附子細辛湯抗炎和免疫抑制的物質基礎。方法：通過比較麻黃附子細辛湯、給藥后含藥血清和空白血清的LC-MS/Ms圖譜，尋找麻黃附子細辛湯的入血成分；ELISA法測定各時間點含藥血清對抗原刺激RBL-2H3細胞釋放組胺、氨基己糖苷酶的影響；MTT法測定各時間點含藥血清對脂多糖誘導小鼠脾細胞增殖的影響，并對相關指標進行回歸分析。結果：灌胃給予麻黃附子細辛湯后，從大鼠血清中發現32個成分，其中27個原型成分，其他5個未知成分。與空白血清相比，麻黃附子細辛湯各時間點含藥血清均能降低抗原誘導RBL-2H3細胞釋放組胺（P<0.05）；除麻黃附子細辛湯4h含藥血清外，其余各時間點含藥血清均能抑制抗原誘導的R BL-2H3細胞脫顆粒（P<0.05）；麻黃附子細辛湯15，30min含藥血清能顯著抑制脂多糖誘導的小鼠脾細胞增殖（P<0.05）。結論：甲基偽麻黃堿、偽庥黃堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭原堿等成分可能為麻黃附子細辛湯抗炎和免疫抑制的部分物質基礎。

[關鍵詞]麻黃附子細辛湯 血清藥物化學 血清藥理學 抗炎 免疫抑制

[中圖分類號]R285.5 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-3089（2017）12-0029-02

麻黃附子細辛湯為張仲景《傷寒論》中的經典名方，由麻黃、附子、細辛3味中藥組成。相關臨床實踐及研究表明，該方在治療過敏性鼻炎方面，具有顯著的療效，且安全可靠、副作用小、療效持久。其藥理是通過抑制肥大細胞和巨噬細胞釋放炎癥介質，發揮抗炎作用，能提高降低抗體活性及激活免疫保護作用。本研究擬運用血清藥物化學和血清藥理學相結合的方法，研究麻黃附子細辛湯抗炎和免疫抑制的物質基礎，旨在為將其開發成預防和治療過敏性鼻炎新制劑，提供一定的實驗依據與參考。

一、材料與方法

（一）材料

1.藥物與試劑。所用的藥物有麻黃、制附子、細辛，均為本院提供的正品。另有辛芩顆粒、醋酸潑尼松片等。

2.動物。Wistar大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，雌雄各半，體重18-22g，SPF級。適應性飼養3d后，開始用于實驗。

3.細胞林。大鼠嗜堿性細胞白血病細胞株RBL-2H3。

4.儀器。CO₂培養箱、倒置顯微鏡、多功能酶標儀、800B離心機等。

（二）方法

先制備麻黃附子細辛湯，濾液濃縮至1.80g-mL^-1生藥量。再制備含藥血清和空白血清的麻黃附子細辛湯。同時，制備體內、外供試品溶液。采用色譜條件和質譜條件進行分析。第四，麻黃附子細辛湯含藥血清的抗炎作用研究含藥血清對抗原誘導。研究麻黃附子細辛湯含藥血清的免疫作用。制備小鼠脾細胞懸液，分析含藥血清對脂多糖（LPS）誘導小鼠脾淋巴細胞增殖反應的影響。

（三）統計分析

所有數據用表示，采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析。如方差齊，組間兩兩比較采用LSD法；如方差不齊，組間兩兩比較采用DunnettsT3，億P<0.05為有差異性顯著。采用SPSS20.0統計軟件進行線性回歸分析（linear regression）。

二、結果

（一）LC-MS/Ms分析體內外麻黃附子細辛湯成分

含藥血清與空白血清比較，含藥血清中發現32個移行成分，其中27個為原型成分，其他5個為未知成分。見圖l。

（二）麻黃附子細辛湯含藥血清對抗原誘導

麻黃附子細辛湯各時間點含藥血清，均能抑制抗原誘導的RBL-2H3肥大細胞釋放組胺（P<0.05）。但不同時間點的強度不同。麻黃附子細辛湯2h含藥血清抑制抗原誘導的R BL-2H3肥大細胞釋放組胺強度，顯著優于15，30min，6h含藥血清組。

（三）麻黃附子細辛湯含藥血清對抗原誘導

與空白血清組相比，除麻黃附子細辛湯4h含藥血清外，其余各時間點含藥血清均能抑制抗原誘導的RBL-2H3肥大細胞釋放β-氨基已糖苷酶（P<0.05）。不同時間點的β-氨基已糖苷酶強度不同。

（四）麻黃附子細辛湯含藥血清對脂多糖（LPS）誘導

與空白血清組相比，麻黃附子細辛湯15，30min含藥血清組能顯著抑制脂多糖誘導的小鼠脾細胞增殖（P<0.05）；麻黃附子細辛湯1，2，4，6h含藥血清組抑制脂多糖誘導的小鼠脾細胞增殖效果不明顯，差異無統計學意義。麻黃附子細辛湯15min含藥血清組與30min含藥血清組之間的差異無統計學意義。

（五）血清藥物化學與血清藥理學指標相關性分析

在被引入回歸方程的9個色譜峰中，P₃₁為細辛中的一個未定性成分、P32為麻黃中的一個未定性成分、P₈為甲基偽麻黃堿、P₆為偽麻黃堿、P₁₃為次烏頭原堿、P₂₂為苯甲酰次烏頭原堿、P₂₀為苯甲酰烏頭原堿、P₁₈為14-苯甲酰-10-羥基-中烏頭原堿、P₁₀為新烏頭原堿。

三、討論

血清藥物化學、血清藥理學在研究中藥藥效物質基礎及藥理作用機制方面，日漸顯示出重要作用。二者結合既能深入研究入血成分，實現快速、準確地研究中藥藥效物質基礎，體現中藥多成分多靶點協同發揮藥效作用特點。在本研究中，血清藥物化學和血清藥理學指標性成分相關性分析表明，與抗炎指標相關的主要為未定性成分P32（麻黃）、未定性成分P31（細辛）、甲基偽麻黃堿、偽麻黃堿，且呈現負相關，說明這4個成分的血藥含量增高，抗炎作用增強，且這4個成分主要來源于麻黃與細辛，這與文獻報道一致；發現麻黃類生物堿中副作用最大的麻黃堿未被引入回歸方程。次烏頭原堿與抗炎指標成正相關，機制尚不清楚。與免疫指標相關的主要為附子的生物堿成分，苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭原堿，呈現正相關，說明這3個成分的血藥含量增高，免疫抑制作用增強。這與文獻報道附子生物堿具免疫抑制作用一致。14-苯甲酰-10-羥基-中烏頭原堿與免疫指標呈現負相關，機制尚不清楚。本文后續實驗將對各化學成分作進行一步的結構確認，并對推測的藥效物質進行細胞實驗和整體動物實驗驗證。