參地顆粒治療慢性腎炎脾腎虧虛證的療效及免疫機制研究?

魏 玲，金 華，王億平△，茅燕萍，張 磊

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，合肥 230031；2.安徽中醫藥大學，合肥 230031)

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【臨床基礎】

參地顆粒治療慢性腎炎脾腎虧虛證的療效及免疫機制研究?

魏 玲1，金 華1，王億平1△，茅燕萍1，張 磊2

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，合肥 230031；2.安徽中醫藥大學，合肥 230031)

目的：觀察參地顆粒對慢性腎炎脾腎虧虛型患者Th17細胞免疫功能的干預作用。方法：90例慢性腎炎患者按隨機數字表法分為試驗組和對照組各45例，2組均給予西醫基礎治療，對照組加用纈沙坦膠囊(代文)80 mg/d，試驗組在對照組基礎上加用參地顆粒，2組療程均為12周。觀察24 h尿蛋白定量(24 hUpro)、尿紅細胞計數(URBC)，并采用流式細胞技術檢測外周血CD4+、CD8+和Th17細胞含量，酶聯免疫吸附法檢測血清白介素-17(IL-17)水平。結果： 試驗組疾病療效總有效率顯著高于對照組。試驗組治療后24 hUpro、URBC與治療前比較均顯著降低，且24 hUpro亦顯著低于同期治療后的對照組。試驗組治療后的Th17含量及IL-17水平與治療前比較均有顯著降低，CD4+、CD4+/CD8+比值顯著提升，且其CD4+/CD8+比值、Th17含量及IL-17水平變化與對照組比較亦差異有統計學意義。結論： 參地顆粒可以通過調節Th17細胞功能，從而改善慢性腎炎脾腎虧虛型患者的免疫功能，發揮臨床療效。

慢性腎炎；參地顆粒；T淋巴細胞亞群；Th-17細胞；白介素-17

慢性腎小球腎炎(簡稱慢性腎炎，chronic glom-erulonephritis，CGN)以蛋白尿、血尿為主要臨床表現，是我國發病率較高的一種難治性免疫介導性疾病，也是引起慢性腎衰竭最常見的原因。免疫功能紊亂在CGN發病機制中起重要作用，尤其是T淋巴細胞的免疫調節異常促使本病的發生和進展[1]。Th17細胞是近年來發現的一種新型輔助性T淋巴細胞亞群，其在腎小球腎炎發病機制中的作用逐漸受到關注。參地顆粒為我院治療慢性腎炎的中藥院內制劑，臨床用于治療脾腎虧虛型CGN近10年，具有顯著降低患者蛋白尿、血尿等作用，且無明顯副作用發生[2]。本研究主要觀察參地顆粒對CGN脾腎氣虛型患者的臨床療效及對T淋巴細胞功能紊亂的調節效應，尤其是對Th17細胞功能的影響，進一步為其臨床應用提供實驗依據。

1 臨床資料

1.1 診斷標準

西醫診斷標準參照文獻制定的慢性腎小球腎炎(CGN)診斷標準[3]。中醫辨證分型標準參照中華中醫藥學會腎病分會2006年制定的標準[4]。脾腎虧虛證：腰脊酸痛，乏力疲倦，面浮肢腫，納少或腹脹，少氣懶言，夜尿頻數，大便溏薄，舌質淡紅邊有齒印，苔薄白，脈細。

1.2 納入標準

符合慢性原發性腎小球腎炎診斷標準者；年齡18～60歲；中醫辨證屬脾腎虧虛證者；24 h尿蛋白定量≤3.0 g/24 h；血肌酐<265 μmol/L(3.0 mg/dl)；簽署知情同意書。

1.3 排除標準

經綜合檢查(實驗室及腎臟病理)證實由狼瘡性腎炎、過敏性紫癜性腎炎、乙型或丙型肝炎相關性腎炎、糖尿病腎病等繼發性腎小球腎炎或腎小球病，Alport綜合征、薄基膜腎病等遺傳性腎小球病；血肌酐≥265 μmol/L(3.0 mg/dl)；妊娠或哺乳期婦女，合并有嚴重心、腦、肝和造血系統等疾病，慢性炎癥疾病(如支氣管哮喘、類風濕性關節炎等)、慢性消耗性疾病(惡性腫瘤、結核、甲亢等)、精神病患者；近半年使用過糖皮質激素或其他免疫抑制劑者。

1.4 病例剔除及終止試驗標準

不符合納入標準，未按規定用藥、合并用藥影響療效者、檢測記錄不全者均應剔除；試驗中出現過敏反應或嚴重不良反應者終止試驗；對于在研究過程中出現腎功能損害加重者(血肌酐升高超過基值50%以上)應終止臨床試驗，并給予相應的治療；因其他種種原因導致療程未結束而退出試驗、失訪者。

1.5 一般資料

表1顯示，選取2013年6月至2016年6月安徽中醫藥大學第一附屬醫院腎內科病房及門診90例患者采用隨機數字表法，根據入組順序編號隨機分為試驗組和對照組各45例，2組在性別、年齡、病程、血肌酐、24 h尿蛋白定量(24 hUpro)、尿紅細胞計數(Urbc)等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。另選取同期來我院體檢的健康人群20例作為正常組，未服用過免疫抑制劑，其年齡(35.7±7.2歲)、性別(男性13例，女性7例)與入組病例比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 患者一般資料比較

2 方法

2.1 治療方法

2.1.1 基礎治療 所有患者均給予基礎治療包括生活方式的干預，即低鹽、低脂飲食，腎功能不全者給予優質低蛋白(0.6～0.8 g/kg·d)及低磷飲食；對癥治療包含降壓(血壓控制目標值為晨測血壓<140/90 mmHg，若血壓≥140/90 mmHg給予鈣離子拮抗劑，若仍不達標再加用α受體阻滯劑、β受體阻滯劑、中樞性降壓藥等，不使用血管緊張素轉化酶抑制劑或除纈沙坦以外的血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、利尿劑)以及調節脂質代謝、抗凝和抗血小板、維持水電解質及酸堿平衡等治療，禁用腎毒性藥物。

2.1.2 對照組 加用纈沙坦膠囊由北京諾華制藥有限公司生產(批準文號120116201)80 mg/d。

2.1.3 試驗組 在對照組基礎上，加用參地顆粒(批號20121027)，由人參、茯苓、熟地、五味子、桑螵蛸、雞內金、川芎等藥物組成)，由我院制劑室濃縮干燥成顆粒劑(每包顆粒劑10 g，約含生藥34 g)，每次1包，每日3次，溫水沖服。2組患者在研究期間禁止使用影響療效的其他藥物，如糖皮質激素、雷公藤多甙片或其他免疫抑制劑，2組療程均為12周。

2.2 觀察指標及方法

分別于治療前及治療12周后檢測以下指標：①采用免疫比濁法檢測24 h尿蛋白定量(24 hUpro)，流式細胞計數法檢測尿紅細胞計數(Urbc)；②采用流式細胞技術檢測外周血CD4+、CD8+和Th17細胞：于晨時(上午8～9點)無菌操作下取患者及正常組人群外周靜脈血約10ml，放入真空肝素抗凝采血管，經Ficoll Hypaque淋巴細胞分離液離心分層，取中心層的外周血單個核細胞(PBMCs)，分別注入熒光素標記的單克隆抗體20 μL，室溫孵育20 min，用PBS緩沖液洗滌2次，加入體積分數為1%的多聚甲醛0.5 ml，上流式細胞儀進行分析，每個樣品收集104個細胞；③采取酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清白介素-17(IL-17)；④安全性指標：檢測血常規、ALT、AST、腎功能、電解質、心電圖等，并記錄用藥期間不良反應的癥狀及體征。

2.3 療效評價標準[4]

臨床控制：24 h尿蛋白定量<0.2 g，且尿紅細胞計數正常。顯效：24 h尿蛋白定量及尿紅細胞計數減少均≥50%；有效：24 h尿蛋白定量及尿紅細胞計數減少均≥25%；無效：上述指標無改善或加重者。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 2組疾病療效比較

表2顯示，2組疾病療效等級分布對照比較差異有統計學意義(Mann-WhitneyU檢驗，P=0.000)；試驗組的疾病療效總有效率顯著高于對照組(χ2檢驗，P=0.030)。

表2 2組疾病療效比較[例(%)]

注：總有效率=(臨床控制+顯效+有效)病例數/總病例數×100%；與對照組比較：*P<0.05

3.2 2組患者治療前后24 hUpro、Urbc比較

表3顯示，治療前2組患者24 hUpro、URBC比較差異無統計學意義(P>0.05)。與同組治療前比較，治療后試驗組24 hUpro、URBC均顯著降低(P<0.05)；對照組僅24 hUpro降低較為顯著(P<0.05)。其中試驗組治療后的24 hUpro亦顯著低于同期對照組(P<0.05)。

表3 2組患者24 hUpro、Urbc比較

注：與同組治療前比較:△P<0.05；治療后與同期對照組比較:*P<0.05

3.3 各組血清CD4+、CD8+、Th17細胞和IL-17比較

表4顯示，對照組和試驗組治療前的外周血CD4+、CD8+、Th17含量、CD4+/CD8+比值及IL-17水平與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)，對照組和試驗組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。試驗組治療12周后Th17含量及IL-17水平與治療前比較差異有統計學意義(P<0.05)，而CD4+、CD4+/CD8+比值顯著提升(P<0.05)；且與同期對照組治療后比較，其CD4+/CD8+比值明顯提升(P<0.05),Th17含量及IL-17水平明顯下降(P<0.05)。

表4 各組血清CD4+、CD8+、Th17細胞和IL-17比較

注：治療前與正常組比較：#P<0.05；與同組治療前比較：△P<0.05；治療后與同期對照組比較：*P<0.05

3.4 安全性評價

2組患者在臨床觀察治療過程期間未發現血常規、肝腎功能、電解質及心電圖等異常；2例患者觀察期間出現輕度腹瀉，考慮為藥物的不良反應，對癥處理后未再出現腹瀉，繼續入組觀察。

4 討論

免疫功能紊亂引起免疫復合物在腎單位異常沉積是CGN發病的起始因素，同時在病變的慢性進展過程中，免疫炎癥介導亦發揮了重要的作用。T細胞介導的細胞免疫功能紊亂與CGN的相關性已得到證實[5]。外周血T淋巴細胞有不同亞群，CD4+代表T輔助細胞(T helper，Th)，具有輔助和誘導功能；CD8+代表T抑制細胞，具有抑制和細胞毒功能；CD4+和CD8+2個亞群間的平衡是維持機體免疫系統正常運作的主要因素。Th17細胞是近來發現的有別于Th1、Th2、Treg的新型CD4+輔助性T細胞亞群，能通過高水平分泌IL-17(IL-17A)等炎癥因子介導機體的慢性炎癥、自身免疫性疾病等多個重要生理或病理進程[6-7]。目前Th17細胞和IL-17在腎小球腎炎發病機理中的作用受到普遍關注[8]。

本研究發現，CGN患者T淋巴細胞功能不全主要表現為CD4+及CD4+/CD8+值降低，而CD8+值增高。CD4+下降主要反映T輔助細胞降低，提示誘導輔助B細胞產生抗體功能下降，CD4+/CD8+值是人體免疫內環境穩態的重要衡量指標，它的降低則提示免疫系統的紊亂程度[9]。CGN患者同時也出現Th17細胞功能紊亂，表現為Th17細胞比例較正常人群明顯增加，其分泌的IL-17水平亦顯著增加，提示Th17細胞及其產生的IL-17在CGN的發生發展過程中起重要作用，有目的地針對Th17細胞或IL-17進行治療可能是治療腎小球腎炎的新轉機。目前認為，Th17細胞可能通過下列方式促進腎小球疾病的進展[10]：一是活化中性粒細胞；二是誘導巨噬細胞分泌IL-1β和TNF-α等炎癥因子；三是直接損傷腎臟固有細胞。其分泌的IL-17能促使腎小球系膜細胞釋放T細胞、巨噬細胞及中性粒細胞的趨化因子，造成腎組織的慢性炎癥和免疫反應[11]。

中醫學認為，CGN屬于中醫“慢腎風”“水腫”“尿濁”“尿血”等范疇，其病變部位主要責之于脾腎。腎為先天之本，脾為后天之本，兩者相互依存、相互為用；腎虛日久，封藏失職，精氣不藏反泄，無以滋養脾陽，脾虛不能運化水谷精微，統攝無權以致精微下注。CGN患者尿中丟失的蛋白為人體重要的精微物質，精微物質耗損是造成脾腎虧虛的主要原因之一，而脾腎虧虛又促進了精微物質的進一步丟失。因此CGN的基本病機是脾腎虧虛、精微下注，其基本治則為健脾益腎、固攝精微。參地顆粒由人參湯化裁而成，后者出自清·新安醫學名家程林刪定的《圣濟總錄纂要·卷十三·虛勞門》，此方以人參為君，補氣攝精；茯苓、熟地黃健脾、補腎為臣；佐以五味子、雞內金、桑螵蛸加強固攝精微之功；川芎活血化瘀、氣血雙調，使補而不滯，亦為佐藥，諸藥合用共奏健脾益腎、固攝精微之效。該方秉承了新安醫學“立法重溫補、著眼在腎”的學術特點，健脾益腎的同時兼顧固攝精微。前期研究發現[2]，參地顆粒能明顯改善CGN脾腎虧虛證患者的臨床表現，降低尿蛋白和尿紅細胞計數，并降低血清白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子水平。本研究肯定了參地顆粒降低CGN脾腎虧虛證患者24 hUpro和Urbc的作用，其降低24 hUpro作用甚至優于纈沙坦膠囊，療效亦顯著優于纈沙坦膠囊。本研究進一步發現，參地顆粒可以升高CGN脾腎虧虛證患者的CD4+細胞比例和CD4+/CD8+值，并降低Th17細胞含量，減少IL-17分泌水平，提示其不僅可以恢復CGN患者機體T淋巴細胞(Th1、Th2)介導的細胞免疫功能紊亂狀態，而且能調節Th17細胞功能，從而發揮對CGN的治療作用。

T細胞亞群的平衡狀態與CGN的轉歸和預后密切相關，調節或糾正失衡的Th1/Th2、Th17免疫細胞網絡系統，在CGN治療中有著廣闊的臨床應用前景。中藥參地顆粒能夠恢復T細胞亞群平衡，調節機體Th17細胞功能，進而改善CGN的病情，值得進一步深入研究。

[1] 黃業華，任偉，楊沐．調節性 T細胞對腎臟疾病的影響[J]．中國臨床保健雜志，2007，10(3)：236-238．

[2] 王億平，史良平，王東，等．參地顆粒治療慢性腎炎脾腎虧虛證臨床研究[J]．安徽中醫學院學報，2011，30(4)：17-20．

[3] 王海燕，鄭法雷，劉玉春，等．原發性腎小球疾病分型與治療及診斷標準專題座談會紀要[J]．中華內科雜志，1993，32(2)：131-134．

[4] 中華中醫藥學會腎病分會．慢性腎小球腎炎的診斷、辨證分型及療效評定[J]．上海中醫藥雜志，2006，40(6)：8-9．

[5] 曹蓓，周慶華，王琛，等．慢性腎炎中醫證型與免疫學指標的相關性分析[J]．上海中醫藥雜志，2015，49(2)：10-13．

[6] PARK H，LI Z，YANG X O，et al．A distinct lineage of CD4T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J]．Nat Immunol，2005，6: 1133-1141．

[7] GRIFIOEN M，VAN DER MEIJDEN ED，SLAGER EH，et al．Identification of Phosphatidylinositol 4-kinase type Ⅱ beta as HIA class Ⅱ-restricted traget in graft vesrus leukemia reactivity[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(10)：3837-3842．

[8] 周樂天，劉伏友．Th17細胞與腎小球疾病的研究進展[J]．中南大學學報：醫學版，2013，38(4)：432-436．

[9] 鄧銀泉．慢性腎炎陰虛和陽虛證與外周血T細胞亞群的關系[J]．中醫藥學報，2010，22(5)：55-56．

[10] KITCHING AR，HOLDSWORTH SR．The emergence of the Th17 cells as effectors of renal injury[J]．J Am Soc Nephrol，2011，22 }2): 235-238．

[11] IYODA M，SHIBATA T，KAWAGUCHI M，et al．IL-17A and IL-17F stimulate chemokines via MAPK pathways (ERK 1/2 and p38 but not JNK) in mouse cultured mesangial cells: Synergy with TNF-α and IL-1β[J]．Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(3)：F779-F787．

Study on the Efficacy and Immune Mechanism of Shendi Granules on the Clinical Treatment in Chronic Glomerulonephritis Patients

WEI Ling1, JIN Hua1, WANG Yi-ping1△, MAO Yan-ping1, ZHANG Lei2

(1.No.1AfficiatedHospital,AnhuiUniversityofTCM,Hefei230031,China; 2.AnhuiUniversityofTCM,Hefei230031,China)

Objective:To observe the intervention effects of Shendi Granules in Th17 cell immune function on chronic glomerulonephritis (CGN) with deficiency of spleen and kidney syndrome patients.Methods:90 cases of CGN patients were randomly divided into experimental group and control group, and each group were 45 cases, giving the basic treatment of Western Medicine. The control group was treated with Valsartan Capsules (80 mg/d) on the basis of the above treatment, the control group plus Shendi Granules on the basis of experimental group treatment. Two groups were treated for 12 weeks. 24 hours urine protein (24 hUpro), urine red blood cell count (URBC) were observed before and after treatment, and flow cytometry was used to determine the content of peripheral blood CD4+、 CD8+and Th17 cells, serum interleukin -17 (IL-17) were measured by enzyme linked immunosorbent assay.Results:The total disease effective rate was significantly higher in experimental group (84.44%) compared with that in control group. 24 hUpro, URBC were significantly reduced compared with that before treatment in experimental group, and 24 hUpro in experimental group was significantly lower than that in control group after treatment. The content of CD4+, CD8+and Th17, the ratio of CD4+and CD8+, and the level of IL-17 in peripheral blood of experimental group and control group before treatment had significant difference compared with those in normal group, while there was no significant difference between experimental group and control group; The content of Th17 and the level of IL-17 was decreased sharply, the content of CD4+and the ratio of CD4+and CD8+was increased obviously in experimental group after treatment, compared with those before treatment；Furthermore, the ratio of CD4+and CD8+, the content of Th17 and the level of IL-17 in experimental group also had significant difference compared with those in control group after treatment.Conclusion:The Chinese medicine of Shendi granules could regulate Th17 cell immune function.so as to improve the immune function of CGN defiency of spleen and kidney syndrome patients. with clinical efficacy.

Chronic Glomerulonephritis (CGN); Shendi granules; T lymphocyte subsets; Th-17 cells; Interleukin-17 (IL-17)

安徽省科技攻關項目(12010402117)-基于免疫炎癥介導機制探討清熱化濕祛瘀法對慢性腎衰竭濕熱證患者的干預作用

魏 玲(1980-),女，安徽郎溪人，主治醫師，醫學碩士，從事中西醫結合治療腎臟病的臨床與研究。

△通訊作者：王億平(1963-)，安徽合肥人，教授，主任醫師，博士研究生導師，E-mail：wypwyp54@aliyun.com。

R285.6

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1006-3250(2017)06-0821-03

2016-12-21