miR-497和miR-34a在鉑敏感和鉑耐藥卵巢上皮癌患者中的表達(dá)差異及機(jī)制研究

曹麗娟，劉文博（承德市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北承德 067000）

miR-497和miR-34a在鉑敏感和鉑耐藥卵巢上皮癌患者中的表達(dá)差異及機(jī)制研究

曹麗娟＊，劉文博（承德市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北承德 067000）

目的：探討微小核糖核酸miR-497和miR-34a在鉑敏感和鉑耐藥卵巢上皮癌（EOC）患者中表達(dá)的差異及機(jī)制。方法：選取2008年1月－2012年1月于我院婦產(chǎn)科行卵巢癌分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的EOC患者72例，術(shù)后均行以鉑類藥物為基礎(chǔ)的規(guī)范化療，并進(jìn)行隨訪（時(shí)間為2008年7月－2016年7月）。根據(jù)患者對(duì)鉑類藥物的敏感性將其分為鉑敏感組（42例）和鉑耐藥組（30例）。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)兩組患者腫瘤組織中miR-497和miR-34a的表達(dá)水平，并考察其與患者總生存時(shí)間的相關(guān)性；采用巢式降落式甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平，采用蛋白印跡法考察組蛋白H3第9位賴氨酸殘基二甲基化（H3K9me2）水平，采用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測(cè)miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2水平。結(jié)果：鉑敏感組患者miR-497和miR-34a的表達(dá)水平均顯著高于鉑耐藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；72例患者的總生存期為（45.7±17.5）個(gè)月，與其miR-497和miR-34a表達(dá)水平呈正相關(guān)（r2分別為0.271 4、0.378 2，P＜0.01）。鉑耐藥組患者miR-497和miR34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平均顯著高于鉑敏感組，且其啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2水平也顯著高于鉑敏感組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而鉑耐藥組患者H3K9me2水平雖略高于鉑敏感組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：EOC患者腫瘤組織中miR-497和miR-34a的表達(dá)水平與鉑化療的敏感性及患者的生存時(shí)間有關(guān)，啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和組蛋白甲基化可能是其表達(dá)變化的機(jī)制之一。

微小核糖核酸；miR-497；miR-34a；卵巢上皮癌；鉑耐藥；DNA甲基化；組蛋白甲基化；啟動(dòng)子區(qū)

卵巢上皮癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中病死率位居第一位[1-2]。分期手術(shù)或細(xì)胞減滅術(shù)后行順鉑為主的化療是目前治療EOC的重要手段之一，但鉑耐藥的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的中心環(huán)節(jié)，且耐藥機(jī)制十分復(fù)雜[3]。微小核糖核酸（miRNAs）是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮基因表達(dá)的調(diào)控作用，參與多種生理及病理過(guò)程[4-5]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-497和miR-34a與卵巢癌細(xì)胞凋亡、侵襲等病理過(guò)程密切相關(guān)，且多種miRNAs可經(jīng)不同機(jī)制參與EOC細(xì)胞鉑耐藥的產(chǎn)生[6-7]。但在此過(guò)程中，miRNAs的異常表達(dá)受何種方式調(diào)節(jié)尚不清楚。DNA甲基化和組蛋白甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要方式，可通過(guò)調(diào)控不同基因的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)EOC細(xì)胞鉑耐藥的產(chǎn)生[8-9]，但其是否影響EOC患者miRNAs的表達(dá)目前仍不清楚。本研究旨在探討miR-497和miR-34a在鉑耐藥和鉑敏感EOC患者中表達(dá)的差異及機(jī)制，并分析其表達(dá)水平與EOC患者生存時(shí)間的相關(guān)性，初步探討miR-497和miR-34a在EOC鉑耐藥中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)后，選取2008年1月－2012年1月在我院婦產(chǎn)科診治的EOC患者72例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）于我院初治的EOC患者；（2）既往無(wú)其他惡性腫瘤病史；（3）經(jīng)卵巢癌分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)治療；（4）術(shù)中冰凍切片及術(shù)后病理檢查確診為EOC；（5）術(shù)前未經(jīng)放、化療及其他方式治療；（6）術(shù)后行以鉑類藥物為基礎(chǔ)的規(guī)范化療；（7）有完整的臨床資料和隨訪資料（包括腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間和總生存期）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并自身免疫性疾病者；（2）肝功能?chē)?yán)重障礙者；（3）嚴(yán)重高血壓及心臟疾病患者；（4）孕婦。

1.2 材料

1.2.1 儀器 QuantStudio?3型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；T100 Thermal Cycler型PCR儀、Mini-PROTEAN?Tetra手灌膠系統(tǒng)、Mini-PROTEAN?3 DodecaTM小型高通量電泳槽和ChemiDocTM凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；5247R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司）。

1.2.2 試劑 miRNA提取試劑盒（批號(hào)：DP501），miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：KR201），miR-497、miR-34a和U6（內(nèi)參）RT-qPCR引物（批號(hào)分別為CD201-0441、CD201-0034和CD201-0145）均購(gòu)自天根生化科技有限公司；AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒（美國(guó)AXYGEN公司，批號(hào)：AP-MN-MS-GDNA-50G）；DNA甲基化修飾試劑盒（北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：D5001）；anti-H3K9me2、anti-H3（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab1220、ab1791）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZDR-5306）；核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（批號(hào)：KGP150）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（批號(hào)：KGP113）均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；蛋白G磁珠（Protein G agarose，美國(guó)ThermoFisher公司，批號(hào)：88803）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國(guó)Hyclone公司，pH＝7.4）；甲醛、甲醇、甘氨酸等為分析純。

1.3 方法

1.3.1 治療與分組方法 術(shù)后所有患者均參照美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南[10]行以鉑類藥物為基礎(chǔ)的規(guī)范化療，并進(jìn)行隨訪。隨訪時(shí)間為2008年7月－2016年7月，隨訪內(nèi)容包括：患者對(duì)鉑類藥物的敏感性、隨訪終止時(shí)患者的總生存時(shí)間等。

參照NCCN指南對(duì)EOC鉑耐藥和鉑敏感的定義[10]、根據(jù)患者對(duì)鉑類藥物的敏感性，將其分為鉑耐藥組和鉑敏感組[鉑耐藥：初次接受鉑類藥物化療，停藥后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；鉑敏感：初次接受鉑類藥物化療，停藥后6個(gè)月及以上復(fù)發(fā)，或不復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)CT、磁共振成像（MRI）或多普勒超聲等影像學(xué)檢查診斷為EOC復(fù)發(fā)]。其中鉑耐藥組患者30例，年齡28～70歲，平均年齡（55.7±7.2）歲；漿液性卵巢癌14例，黏液性卵巢癌10例，子宮內(nèi)膜樣癌6例；早期（Ⅰ～Ⅱ期）16例，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）14例。鉑敏感組患者42例，年齡26～72歲，平均年齡（53.5±6.1）歲；漿液性卵巢癌20例，黏液性卵巢癌12例，子宮內(nèi)膜樣癌10例；早期（Ⅰ～Ⅱ期）24例，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）18例。兩組患者年齡、腫瘤類型和分期比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.3.2 RT-qPCR法檢測(cè)miR-497和miR-34a的表達(dá) 按照miRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取兩組患者腫瘤組織中的miRNA；按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR分析。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)線性梯度良好、熔解曲線峰形單一則表明特異性良好。以內(nèi)參U6的表達(dá)水平為參照，按照2－ΔΔCt法分析待測(cè)miRNA的表達(dá)水平，ΔΔCt＝（Ct待測(cè)物－Ct內(nèi)參）（Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。

1.3.3 巢式降落式甲基化特異性PCR（nt-MSP）法檢測(cè)miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平 按照AxyPrep基因組的DNA小量制備試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取兩組患者的DNA；在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）和Ensembl網(wǎng)站（http：//asia.ensembl.org/index.html）查找miR-497和miR-34a的啟動(dòng)子區(qū)；使用在線甲基化引物設(shè)計(jì)網(wǎng) 站 （http：//www.urogene.org/cgi- bin/methprimer/ methprimer.cgi）預(yù)測(cè)miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)CpG島含量及CpG島分布情況，并設(shè)計(jì)外引物和內(nèi)引物（甲基化和非甲基化引物）（見(jiàn)表1）。采用DNA甲基化修飾試劑盒和亞硫酸鹽修飾法對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾，采用nt-MSP法檢測(cè)其miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的改變。外引物擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)下降0.5℃，直至達(dá)到退火溫度（Tm），72℃再延伸5 min。繼續(xù)以其PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行內(nèi)引物的擴(kuò)增反應(yīng)，條件同外引物。取PCR產(chǎn)物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上成像，分析其甲基化條帶的吸光度（OD甲）值和非甲基化條帶的吸光度（OD非）值，甲基化水平＝OD甲/（OD甲+OD非）。

1.3.4 蛋白印跡法檢測(cè)組蛋白H3第9位賴氨酸殘基二甲基化（H3K9me2）水平 采用核蛋白和漿蛋白提取試劑盒提取兩組患者核蛋白，采用二辛可寧酸（Bicincho-ninic acid，BCA）法進(jìn)行蛋白定量。取核蛋白樣品10 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，切取相應(yīng)位置的凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后采用5%脫脂奶粉封閉2 h，與anti-H3K9me2或anti-H3混合，于4℃下孵育過(guò)夜。洗膜后與HRP標(biāo)記二抗混合，于室溫下孵育2 h，置凝膠成像系統(tǒng)上成像，并分析條帶灰度值。以anti-H3為內(nèi)參，計(jì)算H3K9me2與H3灰度值的比值，考察H3K9me2水平。

表1 miR-497和miR-34a的nt-MSP引物Tab 1 nt-MSPprimers of miR-497 and miR-34a

1.3.5 染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測(cè)miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2水平 將患者EOC組織勻漿后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的甲醛于室溫下固定10 min，以終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸中止交聯(lián)（室溫水平輕微搖動(dòng)5 min）。離心后盡量吸盡上清液，用冷PBS沖洗2次。以SDS裂解液重懸組織沉淀，超聲（25 Hz，超聲15 s，間隔50 s，重復(fù)10次）使DNA破碎為100～1 000 bp大小的片段。以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心15 min后取上清液100 μL，加入anti-H3K9me2 4 μL，于24℃下孵育過(guò)夜，經(jīng)蛋白G瓊脂糖珠沉淀后，于65℃水浴中解交聯(lián)。以純化后的DNA為模板，對(duì)miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。所用引物：上游5′-TTGCCCCACACACTCGAGTG-3′、下游5′-CTCGCAGCCTTTGCCAATTA-3′（miR-497）；上游5′-TTAGAGATTTAAACCGTGAAATGAT-3′、下游5′-TCCTACAACCTAGGTACTCTGGTAC-3′（miR-34a）。反應(yīng)體系及條件、計(jì)算方法同“1.3.2”項(xiàng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以s表示，組間比較采用非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用直線相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者miR-497和miR-34a的表達(dá)水平比較

鉑敏感組患者miR-497和miR-34a的表達(dá)水平（1.29±0.51和1.29±0.43）顯著高于鉑耐藥組（0.58± 0.40和0.59±0.27），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)圖1。

2.2 miR-497和miR-34a表達(dá)水平與EOC患者總生存時(shí)間的相關(guān)性分析

圖1 兩組患者miR-497、miR-34a表達(dá)水平比較Fig 1 Comparison of miR-497 and miR-34a expression levels between 2 groups

隨訪結(jié)果顯示，72例患者的總生存時(shí)間為（45.7± 17.5）個(gè)月，且其miR-497和miR-34a表達(dá)水平與總生存時(shí)間呈正相關(guān)（r2分別為0.271 4、0.378 2，P＜0.01），詳見(jiàn)圖2。

2.3 兩組患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平比較

圖2 miR-497和miR-34a表達(dá)水平與EOC患者總生存時(shí)間的相關(guān)性分析Fig 2 The correlation analysis of miR-497 and miR-34a expression levels with overall survival period of EOC patients

鉑耐藥組患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平[（0.67±0.17）和（0.57±0.22）]均顯著高于鉑敏感組患者[（0.37±0.18）和（0.32±0.20）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)圖3、圖4。

2.4 兩組患者H3K9me2水平比較

圖3 兩組患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化電泳圖Fig 3 DNA methylation electrophorogram of miR-497 and miR-34a promoter regions of 2 groups

與鉑敏感組患者（0.38±0.21）比較，鉑耐藥組患者H3K9me2水平（0.46±0.18）雖有上升趨勢(shì)，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)圖5、圖6。

2.5 兩組患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2水平比較

圖4 兩組患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平比較Fig 4 Comparison of DNA methylation levels in miR-497 and miR-34a promoter regions between 2 groups

圖5 兩組患者H3K9me2凝膠成像圖Fig 5 H3K9me2 gel imaging of 2 groups

圖6 兩組患者H3K9me2水平比較Fig 6 Comparison of H3K9me2 levels between 2 groups

鉑耐藥組患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2水平[（0.61±0.28）和（0.58±0.25）]顯著高于鉑敏感組患者[（0.37±0.22）和（0.45±0.30）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見(jiàn)圖7。

3 討論

圖7 兩組患者miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)H3K9me2水平比較Fig 7 Comparison of H3K9me2 levels of miR-497 and miR-34a promoter regions between 2 groups

EOC發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年可導(dǎo)致全球125 000人死亡[11]。至少約20%的EOC患者對(duì)一線化療藥物天然耐藥，而化療耐藥是導(dǎo)致EOC治療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)和病死率居高不下的重要因素之一[12]。因此，尋找EOC癌細(xì)胞耐藥的靶點(diǎn)，闡明其耐藥機(jī)制是目前亟待解決的問(wèn)題。

既往關(guān)于EOC耐藥的研究多集中于DNA和蛋白水平，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，miRNAs受到越來(lái)越多的關(guān)注。miRNAs是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸，主要通過(guò)與靶信使RNA（Message RNA，mRNA）3′UTR區(qū)結(jié)合、抑制其降解和翻譯等方式來(lái)發(fā)揮抑制基因表達(dá)的作用[13]。miRNAs具有重要的生理學(xué)功能，其表達(dá)異常可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[4-5]。miRNAs可通過(guò)不同機(jī)制或通路來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生：Liu J等[14]研究表明，miR-30a-5p高表達(dá)可增強(qiáng)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成能力，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲，并與卵巢癌細(xì)胞耐藥密切相關(guān)；Zhu H等[15]研究表明，miR-17-92高表達(dá)和miR-134低表達(dá)可導(dǎo)致其靶基因表達(dá)發(fā)生改變，介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生；Wu DD等[16]研究表明，miR-873通過(guò)靶向調(diào)節(jié)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子B亞家族成員1（ABCB1）的表達(dá)水平來(lái)介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的多重耐藥。由此可見(jiàn)，miRNAs的異常表達(dá)可能導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞耐藥。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-497可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)配對(duì)盒2（Paired box 2，PAX2）抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[6]；miR-34a可通過(guò)直接靶向調(diào)節(jié)鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）來(lái)抑制上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、癌細(xì)胞侵襲和癌細(xì)胞團(tuán)形成的能力[7]。但miR-497和miR-34a在鉑敏感和鉑耐藥EOC患者中的表達(dá)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，鉑耐藥組患者miR-497和miR-34a的表達(dá)水平顯著低于鉑敏感組，且其表達(dá)與EOC患者總生存時(shí)間呈正相關(guān)，提示miR-497和miR-34a可能在EOC鉑耐藥中發(fā)揮作用。

DNA甲基化是指基因組內(nèi)CpG島二核苷酸的胞嘧啶被甲基所修飾，從而在不改變基因結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上調(diào)控基因的表達(dá)，是真核生物中一種常見(jiàn)的堿基共價(jià)修飾過(guò)程[17]。組蛋白甲基化是指發(fā)生在組蛋白H3和H4氮端賴氨酸或精氨酸殘基上的甲基化，其功能主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、異染色質(zhì)形成和基因印記等方面，是表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控方式，依據(jù)組蛋白甲基化位點(diǎn)的不同而呈現(xiàn)不同的生物學(xué)效應(yīng)，如組蛋白H3K4位點(diǎn)的甲基化可以導(dǎo)致基因活化，而H3K9二甲基化修飾則是基因沉默的標(biāo)志[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道，表觀遺傳學(xué)機(jī)制在卵巢癌天然耐藥和獲得性耐藥中發(fā)揮了重要作用，藥物治療可逆轉(zhuǎn)異常的表觀遺傳狀態(tài)，因此，正常表觀遺傳狀態(tài)的維持可能成為逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥的潛在靶點(diǎn)[19]。研究表明，與鉑敏感卵巢癌細(xì)胞系比較，鉑耐藥組酵母錯(cuò)配修復(fù)基因人同源物（hMLH1）啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平升高，組蛋白甲基化酶（EZH2）在鉑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP中的表達(dá)高于鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780[20]。由于miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)豐富，且DNA甲基化和組蛋白甲基化具有協(xié)同作用，因此，DNA甲基化和組蛋白甲基化可能參與了miR-497和miR-34a表達(dá)的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，miR-497和miR-34a啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和H3K9me2水平均顯著升高，提示表觀遺傳學(xué)修飾可能影響了miR-497和miR-34a的表達(dá)。

綜上所述，miR-497和miR-34a在EOC鉑耐藥中發(fā)揮著作用，且與EOC患者總生存時(shí)間呈正相關(guān)；啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和組蛋白甲基化可能參與調(diào)控miR-497和miR-34a的表達(dá)。本研究從miRNAs的DNA甲基化和組蛋白甲基化角度出發(fā)，初步探討了EOC鉑耐藥的機(jī)制，為EOC鉑耐藥提供了干預(yù)靶點(diǎn)，但EOC鉑耐藥機(jī)制復(fù)雜，仍有待后續(xù)深入研究。

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（編輯：張?jiān)拢?/p>

Expression Difference and Its Mechanisms of miR-497 and miR-34a in Platinum-sensitive and Platinum-resistant Epithelial Ovarian Carcinoma Patients

CAO Lijuan，LIU Wenbo（Dept.of Gynaecology and Obstetrics，Chengde Municipal Central Hospital，Hebei Chengde 067000，China）

OBJECTIVE：To investigate the expression difference and its mechanism of miR-497 and miR-34a in platinum-sensitive and platinum-resistant epithelial ovarian carcinoma（EOC）patients.METHODS：A total of 72 EOC patients underwent ovarian cancer staging surgery or cytoreductive surgery were selected from department of gynaecology and obstetriscs of our hospital during Jan.2008-Jan.2012.They

standardized platinum chemotherapy after surgery and were followed up（during Jul.2008-Jul.2016）.According to the sensitivity to platinum，those patients were divided into platinum-sensitive group（42 cases）and platinum-resistant group（30 cases）.Real-time fluorescent quantitative PCR was adopted to detect the expression of miR-497 and miR-34a in tumor tissue，and the relationship of it with total survival period was investigated.The levels of DNA methylation of miR-497 and miR-34a promoter region were determined by nest type land type methylation specific PCR.Western blot assay was used to detect the H3K9 dimethylation（H3K9me2）levels.The H3K9me2 levels of miR-497 and miR-34a promoter region were determined by chromatin immunoprecipitation method.RESULTS：The expression levels of miR-497 and miR-34a in platinum-sensitive group were significantly higher than platinum-resistant group，with statistical significance（P＜0.05）.Total survival period of 72 patients was（45.7±17.5）months，which was positively correlated with the expression levels of miR-497 and miR-34a（r2were 0.271 4，0.378 2，P＜0.01）.The DNA methylation of miR-497 and miR-34a promoter region in platinum-resistant group was significantly higher than platinum-sensitive group，and H3K9me2 level of promoter region was significantly higher than platinum-sensitive group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.H3K9me2 levels of platinum-resistant group were slightly higher than that of platinum-sensitive group，but there was no statistical significance（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The expression of miR-497 and miR-34a in tumor tissue of EOC patients are related to the sensitivity of platinum chemotherapy and the survival time of patients.DNA methylation and histone methylation of promoter region may be one of the mechanisms of their expression changes.

MicroRNAs；miR-497；miR-34a；Epithelial ovarian cancer；Platinum resistant；DNA methylation；Histone methylation；Promoter region

R737.31

A

1001-0408（2017）17-2308-06

2016-09-27

2017-04-20）

＊副主任醫(yī)師。研究方向：婦科腫瘤。電話：0314-2028107。E-mail：18603140900@wo.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.17.02