孕35～37周婦女無(wú)乳鏈球菌攜帶狀況及不同方法檢出情況分析

閆津津 王子璇

孕35～37周婦女無(wú)乳鏈球菌攜帶狀況及不同方法檢出情況分析

閆津津 王子璇

目的了解孕35～37周婦女陰道無(wú)乳鏈球菌（GBS）攜帶情況以及不同方法檢出狀況。方法持續(xù)采集北京大學(xué)深圳醫(yī)院產(chǎn)檢門診孕35～37周孕婦陰道分泌物，采用細(xì)菌生化鑒定儀（vitek 2）、質(zhì)譜鑒定技術(shù)和顯色培養(yǎng)基對(duì)GBS進(jìn)行鑒定。結(jié)果共收集陰道分泌物拭子1018例，分離出GBS 112株，總分離率為11.0%。112株GBS vitek 2鑒定112例，質(zhì)譜鑒定112例，顯示培養(yǎng)基顯示110例，3種鑒定方法的檢出率分別為11.0%、11.0%、10.8%；正確率分別為100.0%、100.0%、98.2%。結(jié)論3種鑒定方法對(duì)GBS的鑒定結(jié)果符合率均較高，顯色培養(yǎng)法可作為孕晚期婦女快速篩查GBS的方法，vitek 2和質(zhì)譜鑒定技術(shù)作為最終確證。

無(wú)乳鏈球菌；細(xì)菌生化鑒定儀；質(zhì)譜鑒定；顯色培養(yǎng)基

無(wú)乳鏈球菌（streptococcus agalactiae,GBS），是一種鏈狀排列的革蘭陽(yáng)性球菌，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性[1]。GBS通常被稱為B群鏈球菌，可引起新生兒肺炎、產(chǎn)褥感染以及腦膜炎等。GBS感染與胎膜早破、早產(chǎn)、新生兒敗血癥等有關(guān)，母嬰垂直傳播與大部分新生兒感染GBS密切相關(guān)，女性生殖道GBS檢測(cè)及藥敏分析至關(guān)重要。在生產(chǎn)過(guò)程中GBS通過(guò)產(chǎn)道傳播給新生兒，主要引起新生兒肺炎、腦膜炎等[2]，病死率為5%左右，存活下來(lái)的新生兒可發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如智力缺陷、視覺(jué)或聽(tīng)覺(jué)障礙。中國(guó)孕婦GBS攜帶率與國(guó)外相當(dāng)，為6.5%～30.0%[3]。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）建議在分娩過(guò)程中使用抗生素以預(yù)防孕婦陰道分泌物中分離出的GBS。CDC的建議提出后，早期（產(chǎn)后1周）的GBS感染病死率逐漸降低。青霉素和氨芐西林是治療GBS的首選藥物，若青霉素過(guò)敏，根據(jù)藥敏試驗(yàn)可選用紅霉素和克林霉素。由于預(yù)防用藥，大約20%GBS攜帶者中產(chǎn)生了紅霉素和克林霉素耐藥性。檢測(cè)GBS在預(yù)防孕婦感染起到重要作用，目前，檢測(cè)GBS的金標(biāo)準(zhǔn)是在孕婦孕35～37周時(shí)，結(jié)合陰道和直腸標(biāo)本，通過(guò)選擇性增菌液培養(yǎng)方式診斷GBS。為更好地了解本地區(qū)孕35～37周婦女陰道GBS攜帶情況及不同方法的檢出能力，為臨床預(yù)防和治療新生兒GBS感染提供理論依據(jù)，持續(xù)采集北京大學(xué)深圳醫(yī)院孕35～37周婦女陰道分泌物采取GBS分離培養(yǎng)鑒定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 持續(xù)采集2016年1—12月北京大學(xué)深圳醫(yī)院產(chǎn)檢門診孕35～37周的1018例孕婦陰道分泌物拭子。采集的陰道分泌物拭子首先接種于B族鏈球菌選擇性增菌肉湯中，35 ℃恒溫培養(yǎng)16 h后轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板上，35 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2 方法 選取中等大小、灰白色、周圍有或無(wú)β溶血環(huán)的可疑菌落，顯微鏡檢查提示為陽(yáng)性球菌，呈短鏈狀排列，觸酶試驗(yàn)陰性。所有菌株采用細(xì)菌生化鑒定儀（Vitek 2）（bioMérieux Industry，法國(guó)）和質(zhì)譜儀（北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司）進(jìn)行鑒定，顯色平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）進(jìn)行顯色。

1.2.1 質(zhì)譜儀 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀由主機(jī)、應(yīng)用軟件、儀器控制和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)組成。因?yàn)椴煌|(zhì)量離子擁有不同飛行速度，達(dá)到檢測(cè)器時(shí)間也就不同，離子飛行時(shí)間遵循下列方程：m/z=Kt 2（K為常數(shù)）。借此將不同質(zhì)量的離子分開(kāi)。不同質(zhì)量的離子會(huì)顯示在質(zhì)譜圖上，根據(jù)質(zhì)譜圖峰值能分析出不同的分子，來(lái)判斷為何種微生物。

操作步驟及結(jié)果判讀：

1.3.2 Vitek 2 采用數(shù)碼鑒定原理，每3個(gè)反應(yīng)為1組，組內(nèi)各項(xiàng)反應(yīng)陽(yáng)性時(shí)分別賦值1、2、4，然后計(jì)算每組數(shù)值,將各組反應(yīng)結(jié)果相加。在電腦控制下，讀數(shù)器每隔15 min對(duì)每個(gè)試卡讀數(shù)1次，對(duì)各反應(yīng)孔底物進(jìn)行光掃描，動(dòng)態(tài)觀察反應(yīng)情況。依據(jù)各孔反應(yīng)數(shù)據(jù)作為判斷根據(jù)，并組成生物數(shù)碼，最后與菌種資料庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌生物模型相對(duì)照，獲得系統(tǒng)鑒定值。操作步驟及結(jié)果判讀：①選擇鑒定試卡：革蘭陽(yáng)性球菌鑒定卡。②配置菌懸液：挑取菌落每管加入3 ml 0.45% NaCl溶液配置成0.5～0.63麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙骸＂墼诳苌戏湃腓b定卡。將卡架放入填充倉(cāng)；點(diǎn)擊儀器上填充選項(xiàng)，對(duì)卡片進(jìn)行填充；填充完畢后轉(zhuǎn)裝載倉(cāng)，裝載倉(cāng)對(duì)卡片掃描完畢后，輸入卡片編號(hào)，并保存。④檢測(cè)完成后，查看電腦鑒定結(jié)果。

1.3.3 GBS增菌液 蛋白胨與葡萄糖為細(xì)菌生長(zhǎng)提供能源；結(jié)晶紫可抑制某些革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)而對(duì)鏈球菌無(wú)作用；疊氮鈉和亞硫酸鈉對(duì)革蘭陰性細(xì)菌有抑制作用，對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌則無(wú)作用。檢驗(yàn)方法：①將培養(yǎng)基復(fù)溫至常溫25 ℃；②將采取的標(biāo)本，以無(wú)菌操作方法接種入試管中，搖勻；③置35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h；④無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)的培養(yǎng)基，需連續(xù)觀察7 d，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)方可棄去。

1.3.4 顯色平板 是以人工的方法配制而成的，除基礎(chǔ)培養(yǎng)基外還添加了特異性酶底物，經(jīng)GBS酶解作用釋放出顯色原從而使細(xì)菌呈現(xiàn)不同顏色，以此對(duì)GBS進(jìn)行培養(yǎng)、分離、鑒定。檢驗(yàn)方法：以無(wú)菌方法取樣本直接劃線接種于平板中，或無(wú)菌吸取0.1 ml適當(dāng)濃度的樣本溶液用玻璃涂布棒均勻涂布于平板中，置35℃～37 ℃溫箱中培養(yǎng)，18～24 h后觀察結(jié)果，個(gè)別菌株需要延長(zhǎng)至24 h才能達(dá)到更好的效果。

表1 陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4 質(zhì)量控制 金黃色葡萄球菌ATCC 29213，大腸桿菌ATCC 25922，糞腸球菌ATCC 29212（購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心）進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

共收集1018例孕35～37周婦女陰道分泌物拭子，分離得到112株GBS。3種鑒定方法的檢出率及正確率見(jiàn)表2。

表2 3種鑒定方法GBS檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

GBS感染是圍產(chǎn)期并發(fā)癥發(fā)生的重要原因。本研究中GBS分離培養(yǎng)陽(yáng)性率為11.0%；歐美國(guó)家孕婦泌尿生殖道標(biāo)本GBS分離率為4%～36%，大部分在20%以上[4]；與中國(guó)分離率大致相當(dāng)，但因標(biāo)本采集部位、分離鑒定方法等不盡相同，分離率存在一定差異[5]。

先進(jìn)的GBS檢測(cè)技術(shù)是診斷的重要部分，增菌是提高陽(yáng)性率的第一步。GBS鑒定方法包括數(shù)碼鑒定、比色生化（Vitek）、鑒別培養(yǎng)基、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）、熒光標(biāo)記原位雜交技術(shù)（PCR）、熒光標(biāo)記原位雜交技術(shù)（FISH）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等。分離培養(yǎng)方法是進(jìn)行快速篩查的基礎(chǔ)，但GBS的鑒定篩查試驗(yàn)要求簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，耗時(shí)少，常規(guī)培養(yǎng)方法耗時(shí)長(zhǎng)，適用范圍窄。快速篩查方法的核心通常均是利用GBS較為特異的生物學(xué)性狀，如產(chǎn)生溶血素、色素和特殊基因等重要特征，如免疫檢測(cè)方法乳膠凝集法（LPA），對(duì)于GBS菌量較多孕晚期婦女，篩查效果較好，但需要注意菌量較少的患者可能漏檢。現(xiàn)在有許多新的生化和基因方法，PCR和FISH的發(fā)展為細(xì)菌鑒定提供新的平臺(tái)。對(duì)于來(lái)自臨床的標(biāo)本，GBS特異性PCR運(yùn)用很多新技術(shù)來(lái)提高敏感性和特異性。這些方法的使用對(duì)于預(yù)防GBS和合理使用抗生素起到積極作用。

張秋菊等[6]曾報(bào)道比較普通培養(yǎng)法、先增菌再培養(yǎng)法和顯色平板法陽(yáng)性率分別為8.1%、9.2%、9.4%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明顯色平板法檢測(cè)GBS具有較高靈敏度和特異性，可以直接接種標(biāo)本，操作簡(jiǎn)便，陽(yáng)性率不低于先增菌再培養(yǎng)法，適合各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)用于圍產(chǎn)期GBS篩查。張樹(shù)琛和王杉[7]也曾報(bào)道評(píng)價(jià)過(guò)GBS顯色平板的性能，結(jié)果也表明對(duì)GBS有很好的檢出率。朱佩武等[8]也對(duì)GBS顯色平板應(yīng)用做過(guò)效果評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)除停乳鏈球菌似馬亞種、GBS和少部分溶血葡萄球菌會(huì)在此顯色平板上顯紫色外，其余皆不顯紫色，而這3種細(xì)菌在血平板上根據(jù)細(xì)菌形態(tài)不同較好區(qū)分。均與本研究結(jié)果符合，雖然檢出率不盡相同，但是顯色培養(yǎng)基作為醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法還是可靠的。本研究質(zhì)譜儀檢測(cè)GBS結(jié)果與Vitek 2完全一致，但是操作較為繁瑣，過(guò)程中影響因素很多，人為造成的失誤會(huì)影響最后的質(zhì)譜圖導(dǎo)致結(jié)果不符合，但是正確操作檢出GBS準(zhǔn)確率較高。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯色培養(yǎng)基和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀均適用于檢測(cè)GBS。其中顯色培養(yǎng)基成本較低，操作簡(jiǎn)單，而且結(jié)果觀察方便，但是需要隔天才能觀察結(jié)果，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，而且會(huì)有其他菌落的污染。飛行時(shí)間質(zhì)譜儀操作稍微繁瑣，但是耗時(shí)短，2 h即可出結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高，但是成本較高。各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)可結(jié)合自身情況選擇不同檢測(cè)方法。

隨著圍產(chǎn)期抗生素預(yù)防策略的廣泛實(shí)施，GBS問(wèn)題日趨嚴(yán)重，提高檢出水平，為有效防治新生兒GBS感染，保護(hù)產(chǎn)婦及其胎兒健康提出更合理的預(yù)防措施及更有效的解決方案。

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10.12010/j.issn.1673-5846.2017.06.042

北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳 518036

閆津津（1980.2-），碩士學(xué)位，主管技師。研究方向：臨床檢驗(yàn)