微球法檢測干眼患者淚液中IFN-γ與IL-17細胞因子濃度的相關分析

孟紫薇 崇曉霞（通訊作者）

（內蒙古醫科大學附屬醫院眼科，內蒙古呼和浩特010030）

微球法檢測干眼患者淚液中IFN-γ與IL-17細胞因子濃度的相關分析

孟紫薇 崇曉霞（通訊作者）

（內蒙古醫科大學附屬醫院眼科，內蒙古呼和浩特010030）

目的通過微球法（Cytometric bead array，CBA），即微量樣本多重蛋白定量技術測定干眼患者與正常對照組淚液中的兩種細胞因子IFN-γ（Interferon-γ）與IL-17（Interleukin-17）的濃度，探討炎癥因素在干眼的發病機制中的作用。分析各組淚液中IFN-γ與IL-17兩種細胞因子的濃度與臨床檢查結果的相關性。方法本研究為2015年至2016年內蒙古醫科大學附屬醫院眼科門診就診的患者，進行包括視力、淚膜破裂時間（Break up time，BUT）、淚液分泌實驗I（Schirmer I test，SⅠt），依據日本干眼標準（2005）篩選功能性干眼患者21例（21眼：14例右眼，7例左眼），其中男4人（4眼：2例左眼，2例右眼），女17人（17眼：12例右眼，5例左眼），眼別篩選依據患者自覺癥狀較為嚴重的一側。依據正常對照組標準篩選健康志愿者18例（18眼：11例右眼，7例左眼），其中男4人（4眼：2例左眼，2例右眼），女14人（14眼：9例右眼，5例左眼），眼別選取與病例組性別相匹配（兩組間每側眼男女比例接近1：1）。使用毛細管法收集上述兩組淚液。通過CBA法檢測淚液樣品中IFN-γ與IL-17的濃度，并與臨床檢查結果進行相關分析。結果正常組與對照組的年齡、性別無統計學差異（P=0.558）。兩組被檢者SⅠt有統計學差異（P＜0.001）；兩組淚液樣本中IL-17濃度與SⅠt有統計學意義（r=0.38，P=0.001）；被檢者SⅠt結果與BUT結果相關性有統計學意義（P＜0.001）。結論①兩組被檢者淚液中的細胞因子濃度并未發現有統計學差異，但病例組IFN-γ濃度中位數較對照組高。②兩組被檢者SⅠt結果與BUT結果有統計學差異，說明傳統方法檢測仍是不可代替的檢查方法。且SⅠt與BUT是評估干眼的敏感指標。③被檢者IL-17濃度與SⅠt結果存在正相關性，推斷IL-17濃度的增加對淚液的減少分泌是一種保護性因素。

干眼；CBA法；IFN-γ；白細胞介素

干眼是常見眼病，是由于淚液的質或量或流體動力學異常引起的淚膜不穩定和（或）眼表損害，從而導致眼不適癥狀及視功能障礙的一類疾病[1]。發病率逐年增高，臨床癥狀多樣，癥狀與臨床檢查結果的一致性差。有研究表明淚膜滲透壓的升高和炎癥原因都是導致干眼的重要因素[2]，研究淚液中的炎性因子的變化，能夠發現炎癥因素與干眼相關性。關于淚液中的蛋白質國外Zhou等[3]曾報道了正常人淚液中包含1500多種蛋白。在淚液中占20%左右的四種主要蛋白分別是溶菌酶、乳鐵蛋白、分泌型免疫球蛋白（Secretory immunoglobulin A，SIgA）以及載脂蛋白lipocalin。干眼中致病的免疫細胞中不斷活化的主要是CD4+T細胞，Th17作為一種CD4+T細胞，特異性分泌IL-17家族細胞因子[4]，IL-17主要是指IL-17A，輔助性T細胞-17（T helper cell，Th17）是2005年研究自身免疫疾病時發現的新型Th亞群，Th17可以產生多種細胞因子，包括IL-17、IL-21等，Th17以及它所產生的細胞因子能夠介導炎癥反應從而成為疾病的重要發病環節[5]，并且Th17細胞抑制作用的喪失可能會導致干眼。Th17細胞參與發病機制在于眼表干燥環境導致Th17細胞誘導因子，如IL-6、轉化生長因子-β、IL-23等增強表達，通過信號傳導促進Th17細胞分化分泌效應IL-17。IL-17還參與了中性粒細胞的增生、成熟和趨化并能夠促進樹突狀細胞的成熟[6]，IL-17與受體結合，分泌基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和炎性因子，導致眼表上皮損傷，加重干眼病情。Li等[7]認為IL-12、IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α等細胞因子均誘導小的富含脯氨酸蛋白1B（SPRR1B），而SPRR1B是眼表上皮鱗狀化生的標志。原有研究發現干燥綜合癥患者的淚腺及涎腺中存在IFN-γ的高表達[8]。干擾素IFN可分為兩型，IFN-α與IFN-β屬于I型干擾素，主要的功能是消除病毒。IFN-γ屬于II型干擾素，主要功能是介導和調節特異性免疫[9]。并且有研究[10-11]證實過Th1型細胞與IL-17之間存在相互調節，IL-17可以與IFN-γ共同作用，并且放大其致炎作用。

由于干眼患者淚液較少，所以采用Cytometricbead array（CBA）即微量樣本多重蛋白定量技術，這是一個基于流式細胞檢測系統的多重蛋白定量測定方法，這種方法靈敏度高，而且可以同時檢測多種蛋白，能夠解決樣本量較少的問題。它利用不同的捕獲微球包被有特異性的捕獲抗體，與待測樣品帶有的自身抗原結合后，加入檢測抗體，孵育形成“三明治”復合物，檢測抗體帶有不同的熒光強度，通過流式細胞儀可分析結果。

1 材料與方法

1.1 研究對象：選取2015至2016年內蒙古醫科大學附屬醫院眼科門診就診的患者進行篩查。干眼組：按照納入標準確定功能性干眼患者21例，其中男4人，女17人。及健康志愿者18人，其中男4人，女14人，眼別選取與病例組性別相匹配。所有研究對象都要進行基礎眼部檢查包括視力檢查、眼壓、裂隙燈檢查、直接眼底鏡檢查、SⅠt以及BUT檢查。所有相關檢查均取得患者同意后進行。

1.2 檢查以及收集方法

1.2.1 SⅠt基礎淚液分泌實驗：將測試淚液專用濾紙一端使用無菌鑷反折5 mm，輕輕置于患者下瞼結膜囊中外1/3處，另一端自然下垂，囑受檢者輕輕閉眼，5 min后觀察濾紙被淚液濕潤的長度。

1.2.2 BUT檢查：使用Tomy全自動角膜地形圖儀準確測量BUT時間。調整機器使用BUT模式，囑患者正常瞬目兩次后，使用角膜地形圖儀測量被檢者淚膜破裂時間，三次取平均值。

1.2.3 毛細管法收集研究對象淚液：在受試者瞬目數次后用40 μL毛細管于患者外眥部收集淚液，在不刺激到患者的情況下收集淚液約5 μL，迅速送往-80℃冰箱保存樣本，待使用。

1.2.4 角膜熒光素染色：評分方法規定，無染色為0分，將角膜平均分為四個象限，每個象限又分為輕、中、重度三級，共為0～12分，規定＜1分為正常。

2 結果

2.1 年齡性別對比：病例組與正常對照組在年齡（P=0.67）、性別（P=1.00）分布上無統計學差異。

2.2 臨床檢查結果比較：病例組IL-17A濃度為（3279.80±1584.21）fg/mL，正常組濃度為（4086.46± 1980.14）fg/mL。病例組IFN-γ濃度中位數為3362.37（1493.62～5732.51）fg/mL，正常對照組濃度中位數為3975.20（2552.63～13334.25）fg/mL，兩組IFN-γ和IL-17比較無統計學差異。干眼組患者BUT平均值為（2.18±2.18）s，正常組患者的BUT為（4.85±2.40）s。SⅠt正常組為（18.00±5.86）mm，干眼組為（10.00±7.88）mm。兩組被檢者BUT和SⅠt存在統計學差異（P＜0.001），詳見表1。

表1 干眼組與正常對照組臨床檢查結果

2.3 相關性分析：淚液樣本中IL-17濃度與SⅠt存在相關性（P=0.001），淚液樣本中IL-17濃度與BUT結果沒有相關性（P=0.25），IFN-γ濃度BUT結果無相關性（P=0.31）。IFN-γ濃度與臨床檢查SⅠt結果沒有相關性（P=0.484），SⅠt結果與BUT結果存在相關性（P＜0.01），詳見圖1和圖2。

2.4 男女性別IFN-γ和IL-17比較：正常組中男性與女性淚液中IFN-γ（P=0.40）與IL-17（P=0.43）濃度均無統計學差異，干眼組患者男性與女性淚液中IFN-γ（P=0.53）與IL-17（P=0.38）濃度無統計學差異。

圖1 受檢者淚液中IL-17濃度與SⅠt相關性分析

圖2 受檢者BUT檢查及SⅠt檢查結果相關性分析

3 討論

1996年美國國立眼科研究所干眼研究組將角結膜干燥癥與干眼癥作為同一概念，稱為干眼[12]。所以干眼包括了淚膜不穩定，淚液缺乏引起的干燥，還包括眼表上皮病理改變發生的干燥癥狀。本研究雖然在所有的樣本中均檢測出IFN-γ與IL-17A兩種淚液蛋白的濃度，但是并未發現干眼組和正常對照組兩種蛋白濃度存在有統計學意義的差異。所以本研究中淚液IL-17A與IFN-γ兩種細胞因子的濃度并不能成為判斷炎癥因素參與干眼發病的指標，但病例組IFN-γ濃度中位數較對照組高，能夠提示病例組淚液中的IFN-γ濃度與正常對照組有一定差異。本實驗中兩組淚液中IL-17A濃度并未發現差異，但SⅠt結果與淚液樣本中IL-17A濃度呈正相關。淚液分泌的量與IL-17A濃度存在正相關性，說明被檢者淚液的分泌量與細胞因子的濃度有關，病例組的淚液分泌量明顯少于對照組，但兩者的IL-17A濃度并沒有差異，由此推斷被檢者IL-17濃度與SⅠt結果存在正相關性，可能IL-17濃度的增加對淚液的減少分泌是一種保護性因素。兩組患者SⅠt結果BUT結果統計學上均有顯著性差異，說明兩組患者在淚液的質和量都存在明顯差異。

本實驗過程中存在諸多不足，實驗沒有統一收集淚液的時間，并不能確定上午下午被檢者淚液中蛋白含量是否一致。而且針對患者的主訴并未使用調查表記分制和角膜熒光素染色記分制來評估，未能發現臨床癥狀的特異性與淚液中炎性因子的相關性，因此可能對本研究結果造成一定的影響。進一步的研究中，應該結合干眼患者癥狀體征評分表，能夠更加明確患者的臨床癥狀與檢查的相關性。并且在一天內的不同時間收集患者淚液可以獲得淚液中細胞因子的變化規律，還應該對比治療后的同一批患者淚液，以觀察細胞因子的變化，分析淚液中的致炎因子與疾病發病與轉歸的關系。

［1］中華醫學會眼科學分會角膜病學組.干眼臨床診療專家共識（2013年）［J］.中華眼科雜志，2013，49（1）：73-75.

［2］Bron AJ.The definition and classification ofdry eye disease［M］.DryEye，2015，21（3）：1-19.

［3］Lei Z，ShaoZZ，Koh SK，et al.In-depth analysis ofthe human tear proteome［J］.Journal ofProteomics，2012，75（13）：3877-3885.

［4］Langrish CL，Chen Y，Blumenschein WM，et al.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation［J］.Journal of Experimental Medicine，2005，201（2）：233-240.

［5］HarringtonLE，hattonRD.linterleukin17-producingcd4effect t cell develop via a lineage distinct from the Thelper type1and 2 lineages［J］.Nat Immunol，2005，6（3）：1123-1132.

［6］高彩鳳，陳慧瑾，靳瑛，等.Th17相關細胞因子在干眼患者眼表的表達及其相關性研究［J］.中華實驗眼科雜志，2014，32（7）：641-646.

［7］Li S，Nikulina K，Devoss J，et al.Small proline-rich protein 1B（SPRR1B）is a biomarker for squamous metaplasia in dryeye disease［J］.Investigative OphthalmologyVisual Science，2008，49（1）：34-41.

［8］Fox RI，Kang HI，Ando D，et al.Cytokine mRNA expression in salivary gland biopsies of Sj gren's syndrome［J］. Journal ofImmunology，1994，152（11）：5532-5539.

［9］張梅，劉祖國，陳家祺，等.γ-干擾素對培養人原代結膜及淚腺上皮細胞表達炎癥相關因子的影響［J］.眼科新進展，2003，23（4）：229-232.

Analysis of IFN-Gamma and IL-17 Vytokine Determination in Dry Eye Tears by Cytometric Bead Assay

Meng Ziwei Chong Xiaoxia
（Department of Ophtalmology，Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital，010030，China）

ObjectiveThe concentrations of two cytokines IFN-γ（Interferon-γ）and IL-17（INTERLEUKIN-17）in tear in dry eyes and normal control group were measured by Microsphere method（Cytometric Bead Array，CBA，which is a micro-sample multiple protein quantification technique），and the role of inflammatory factors in the pathogenesis of dry eye was investigated.2.Analysis of the correlation between the concentrations of IFN-γ and IL-17 two cytokines in tear and the Clinical examination results：MethodsFor the 2015-2016，Inner Mongolia Medical University affiliated hospital ophthalmic outpatient clinic patients，including vision，tear film rupture time（break up Time，BUT），tear secretion experiment I（Schirmer i test，SⅠt），According to Japan Dry Eye Standard（2005）screening functional Dry eye patients 21 cases（21 eyes；14 cases of the right eye，7 cases left eye，the male 4（4 eyes，2 case left eye，2 case right eye）female 17（17 eyes；12 cases right eye，5 case left eye），eye screening according to patient conscious symptom more serious side.Screening healthy volunteers in 18 cases（18 eyes，11 right eyes，7 left eyes）According to the normal control group.Among the men 4（4 eyes，2 cases left eye，2 case right eye）female 14（14 eyes，9 cases of right eye，5 case left eye），eye selection and case Group Sex match（two group between men and women in each side of the proportion of close to 1：1）. The two groups of objects were collected by capillary method.The concentration of IFN-γ and IL-17 in tear samples was detected by CBA method，and the correlation was correlated with clinical examination results.ResultsThere was no statistically difference between the age and sex of the normal group and the control group（P=0.558）.There were statistically significant differences between the two groups of SⅠt（P＜0.001）；the correlation between IL-17 concentrations and S-t results in two groups of tear samples was statistically significant（r=0.38，P=0.001）；the correlation of SⅠt results with BUT results was statistically significant（P＜0.001）. ConclusionThe concentrations of cytokines in tear in two groups were not found statistically significant，but the median number of IFN-γ concentrations in the case group was higher than that of the control group.There are significant differences in statistics between s t and BUT results in two groups，indicating that the traditional method detection is still irreplaceable.And the SⅠt and BUT are sensitive indices for evaluating dry eyes.The IL-17 concentration of the detector and the SⅠt results are positively correlated，and the increase of IL-17 concentration is a protective factor in reducing tear secretion.

Dry eye；Cytometric bead assay；IFN-gamma；Interleukin-17

R777.34

A學科分類代碼：32037

1001-8131（2017）03-0230-03

2017-03-15