地黃飲子對腦缺血再灌注大鼠海馬腦源性神經營養因子和基質細胞衍生因子表達的影響

姚姝娛

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·基礎醫學· ·論著·

地黃飲子對腦缺血再灌注大鼠海馬腦源性神經營養因子和基質細胞衍生因子表達的影響

姚姝娛

目的 探討地黃飲子對腦缺血再灌注大鼠海馬腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)和基質細胞衍生因子(stromal cell derived factor 1, SDF1)的表達及修復神經元的作用機制。方法 選取清潔級SD大鼠75只，按數字表法隨機分為正常組、治療組和缺血組，每組25只。10%水合氯醛麻醉，暴露并鉗夾雙側頸總動脈40 min，造模使大鼠急性腦缺血。治療組：造模后灌服地黃飲子湯36 g/kg；缺血組：造模后每日胃灌鹽水1次；正常組：正常飲食。3周后，測量大鼠腦梗死面積，分別測定3組大鼠腦海馬CA1區BDNF和SDF1蛋白表達情況。結果 正常組海馬CA1區BDNF(99.25±9.48)和SDF1蛋白含量[(2.59±0.76) mg/L]均明顯高于地黃飲子治療組[BDNF:(79.98±10.68), SDF1蛋白含量： (3.68±0.96) mg/L]]和缺血組[BDNF:(59.59±13.73)，SDF1蛋白含量：(0.93±1.24) mg/L]，差異有統計學意義(P<0.05)。地黃飲子治療組BDNF和SDF1蛋白含量明顯高于缺血組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組的腦梗死面積明顯低于缺血組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 地黃飲子治療可以提高BDNF和SDF1蛋白水平，增加內源性保護機制和神經干細胞增殖、遷移，保護神經元的功能。

腦缺血再灌注；大鼠海馬；腦源性神經營養因子；基質細胞衍生因子

腦缺血再灌注是近年來醫療界非常重視的研究領域，為臨床上腦血管急性缺血期的治療提供有力的依據。腦缺血包括大腦的神經損傷和神經生長因子的修復、神經功能缺失[1-2]等，在臨床上造成較高的致殘率，甚至死亡，由缺血造成的腦血管病占所有腦血管病的80%[3]，因此及時有效的治療，可減少腦卒中的發生。腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)和基質細胞衍生因子的釋放1(stromal cell derived factor 1, SDF1)，都是神經營養家族的成員，都具有減少自由基、減少神經細胞凋亡、保護神經元等作用。本研究通過觀察BDNF和SDF1蛋白表達情況，探討BDNF和SDF1修復神經功能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康清潔級成年SD大鼠75只，雌雄不限，體質量250～280 g，由中國醫科大學動物部提供，動物合格證號：SCXK-LN2014-0007。按數字表法隨機分為治療組、缺血組和正常組，每組25只。治療組：造模后灌服地黃飲子湯36 g/kg，連續3周。缺血組：造模后每日胃灌鹽水1次，連續3周。正常組：正常飲食。本實驗經醫院倫理委員會批準，對實驗動物的處置符合《善待實驗動物指導意見》中相關規定。

1.2 動物模型的建造 參照文獻[4]。

1.3 地黃飲子湯的配制 按照《黃帝素問宣明論方》記載的地黃飲子配制：熟地黃12 g、白茯苓12 g、山茱萸15 g、巴戟天15 g、麥門冬15 g、肉蓯蓉15 g、石斛15 g、炮附子15 g、菖蒲12 g、官桂10 g、遠志10 g、五味子10 g。用12倍量和10倍量水煎煮2次，每次1 h，將2次藥液混合，用旋轉儀蒸發濃縮，干燥密封備用。

1.4 BDNF和SDF1含量的測定 采用免疫組織化學測定海馬CA1區BDNF和SDF1蛋白含量，對所有大鼠麻醉灌流固定大腦，石蠟包埋并石蠟切片。脫蠟、水化，滅活內源性過氧化物酶活性，抗原修復，滴加兔抗人BDNF多克隆抗體(北京博奧森生物有限科技公司，濃度1∶300)，滴加鼠抗BrdU單克隆抗體(北京博奧森生物有限科技公司，濃度1∶50)，濕盒中4 ℃冰箱過夜。SABC(1∶150)試劑盒檢測大鼠腦CA1區BDNF和BrdU，DAB顯色，最后脫水封片。具體步驟：(1)采用日本Olympus圖像分析儀，400倍視野下計數BDNF和BrdU的陽性細胞數量。(2)用MetaMorph Offline 4.65圖像分析鼠腦海馬CA1區BDNF蛋白含量的平均積分光密度(IOD)，選取平均測量值。(3)參照大鼠腦圖譜，取大腦海馬組織，加入體積比10∶1的PIPA裂解液中，分離的蛋白溶解，用ELISA測定腦組織蛋白中SDF1的含量(參照說明書步驟)。

1.5 測量大鼠腦梗死面積 實驗3周后，斷頭取腦，鹽水沖洗大腦并吸干，將大腦冠狀切片，加入1%2，3，5-三苯基四氮唑的磷酸緩沖液中進行染色，避光30 min，間隔6 min轉動1次，腦片拍照，采用Imagepro Plus 6.0圖像分析儀，計算腦梗死面積，腦梗死比例(%)=(白色的梗死面積/片子的總面積)×100%。

1.6 統計學處理 用SPSS 17.0統計學分析，多組間用單因素方差分析比較，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 地黃飲子對大鼠腦海馬CA1區BDNFIOD值和SDF1蛋白含量的影響 正常組BDNFIOD值和SDF1蛋白表達明顯高于治療組和缺血組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組BDNFIOD值和SDF1蛋白表達明顯高于缺血組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠腦海馬CA1區BDNF蛋白IOD值和SDF1蛋白含量比較(x±s)

注：與正常組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。IOD：平均積分光密度，BDNF：腦源性神經營養因子，SDF1：基質細胞衍生因子

2.2 地黃飲子對大鼠腦梗死面積的影響 治療組的腦梗死面積(16.84%)明顯低于缺血組(37.58%)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 3組大鼠腦海馬CA1區免疫組化染色情況 圖1可見SDF1蛋白圓形細胞核大，棕黃色圓形，正常組比治療組和缺血組的SDF1蛋白含量高，治療組比缺血組的蛋白含量高。圖2可見BDNF蛋白多邊形，細胞核大呈圓形，棕褐色橢圓形，正常組BDNF蛋白表達多于治療組和缺血組，治療組BDNF蛋白表達多于缺血組。

注：A：治療組；B：缺血組；C：正常組。SDF1：基質細胞衍生因子圖1 3組大鼠腦海馬CA1區SDF1蛋白免疫組化圖示(×400)

注：A：治療組；B：缺血組；C：正常組。BDNF：腦源性神經營養因子圖2 3組大鼠腦海馬CA1區BDNF蛋白免疫組化圖示(×400)

3 討論

BDNF廣泛分布在腦組織中，主要集中在大腦海馬CA1區和大腦皮層，其含量直接影響神經系統的發育，對神經細胞的增殖、生長和分化起到促進作用，并有保護神經元、促進神經元再生等功能。BDNF通過與腦源性神經營養因子的受體(TrkA)結合，激活傳導信號，促進神經細胞再生和保護神經元的作用；同時，BDNF還具有促進細胞增殖、形成新生血管、減少神經元損傷[5-6]、逆轉神經細胞凋亡的傳導通路、激活神經細胞再生[7]的作用。有研究表明[8]，腦缺血再灌注后大鼠腦皮層的BDNF mRNA表達減少；同時，有研究[9-10]證實，大腦缺血區的BDNF減少，造成腦梗死面積增加，與本實驗結果一致，可以得出結論腦缺血損傷造成了BDNF表達減少。

SDF1是增強神經信息傳遞、調節神經功能的重要因子，腦缺血發生后，腦細胞水腫的同時產生大量的自由基、細胞因子、炎性因子等，SDF1通過CXCR4傳導信號，使海馬區的神經干細胞誘導SDF1發生遷移、分化至缺血區，并分化為神經元，演變為神經細胞使受損的神經得到修復[11]。有研究表明[12]，地黃飲子治療后腦缺血區SDF1蛋白含量增加，神經干細胞遷移和增殖增多。本實驗得出結果，大鼠腦缺血區海馬SDF1蛋白含量明顯低于正常組，經治療后SDF1蛋白表達明顯增高，腦梗死面積減少，提示得到修復的神經細胞和遷移的神經元增多，減輕了腦水腫和腦損傷，對腦組織起到有效的保護作用。

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(本文編輯：林永麗)

Expression and significance of brain derived neurotrophic factor and stromal cell derived factor 1 in the hippocampus of rats with cerebral ischemia reperfusion

YaoShuyu

(AffiliatedHospitalofLaoningChineseHerbalMedicineUniversity,Shenyang110032,China)

Objective To explore the expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) and stromal cell derived factor 1(SDF1) in the hippocampus of rats following cerebral ischemia reperfusion, and the mechanism involved in the repair of neurons.Methods Seventy-five SD rats were randomly divided into the normal group, the treatment group and the ischemia group, each consisting of 25 animals. Chloral hydrate at a concentration of 10% was used to induce anesthesia. Bilateral common carotid artery was exposed and clipped for 40 minutes to develop an acute cerebral ischemia model. Following development of the model, the treatment group was given rehmannia Yinzi liquid by gavage at a dosage of 36 g/kg, while the ischemia group received physiological saline also by gavage once a day. The normal group was given normal feed. Three weeks later, the areas of cerebral infarction were detected, and the expression levels of BDNF and SDF1 were respectively detected in CA1 of the hippocampus.Results The levels of BDNF (99.25±9.48) and SDF1 [(3.68±0.96) mg/L] in CA1 in the animals of the normal group were all significantly higher than those of the treatment group [ (79.98±10.68) and (2.59±0.76) mg/L] and the ischemia group [ (59.59±13.73) and (0.93±1.24) mg/L], and statistical significance could be seen, when comparisons were made between them (P<0.05). The levels of BDNF and SDF1 in the rehmanniae Yinzi treatment group were also obviously higher than those of the ischemic group, also with statistical significance (P<0.05). The area of cerebral infarction of the treatment group was significantly smaller than that of the ischemia group, also with statistical significance (P<0.05).Conclusion Rehmannia Yinzi liquid could increase the levels of BDNF and SDF1, improve the endogenous protective effect, enhance the proliferation and migration of stem cells, and had the function to protect neurons.

Cerebral ischemia reperfusion; Hippocampus; Brain derived neurotrophic factor; Stromal cell derived factor 1

110032 沈陽，遼寧中醫藥大學附屬醫院

Q95-33

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.03.012

2016-04-08)