甲基蓮心堿對紫外線致人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響*

曹 瑾，楊壯群，Abidullah Khan，舒茂國，溫繡藺，王 瑞，白轉(zhuǎn)麗

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容頜面外科(西安 710061)

甲基蓮心堿對紫外線致人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響*

曹 瑾，楊壯群，Abidullah Khan，舒茂國，溫繡藺，王 瑞，白轉(zhuǎn)麗△

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形美容頜面外科(西安 710061)

目的：探討甲基蓮心堿對紫外線致人成纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，為防治皮膚光老化性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：建立中長波紫外線輻射人皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型，實(shí)驗(yàn)分為對照組、模型組(單純紫外線照射)和藥物組(紫外線照射加甲基蓮心堿干預(yù))，觀察和分析成纖維細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后細(xì)胞生長形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：紫外線照射成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞失去正常形態(tài)，超微結(jié)構(gòu)顯示線粒體損傷，而經(jīng)甲基蓮心堿處理后細(xì)胞損傷明顯減輕。結(jié)論：適當(dāng)濃度(0.8μM)的甲基蓮心堿能減輕紫外線照射后成纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷，為防治皮膚光老化疾病提供了新的治療思路。

由紫外線輻射(Ultraviolet radiation, UVR)所致的皮膚老化稱光老化。隨著臭氧層的破壞和紫外線輻射量的增加，皮膚光老化受到越來越高的重視。研究表明，ROS介導(dǎo)的氧化損傷是UVR導(dǎo)致皮膚光老化的重要機(jī)制[1-3]。而植物類抗氧化劑的抗光老化作用越來越成為研究熱點(diǎn)。甲基蓮心堿(Neferine, Nef)是一種從蓮子芯中提取出的生物堿。研究表明Nef具有抗氧化等多種藥理作用[4-7]，而Nef是否具有抗皮膚光老化作用目前國內(nèi)外未見研究報(bào)道。本研究通過建立中長波紫外線輻射人皮膚成纖維細(xì)胞光老化模型，觀察成纖維細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后細(xì)胞生長形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化，以及甲基蓮心堿對成纖維細(xì)胞紫外線照射后細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 人皮膚成纖維細(xì)胞株(HSFs) 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

2 儀器和試劑 Nef(pure one Biotechnology laboratories公司)，無酚紅DMEM培養(yǎng)基(ref#21063-029，Gibco life technologies公司)，0.25%胰蛋白酶(Gibco life technologies公司)，胎牛血清(SV30087.01，Hyclone thermo scientific公司)，DPBS(SH30256.01B， Hyclone thermo scientific公司)，DMSO(Hyclone thermo scientific公司)，MTT試劑盒(G020-1，南京建成生物工程研究所)

3 甲基蓮心堿的配制 將10 mg的甲基蓮心堿溶解于0.2 ml的DMSO之后加入125 ml無酚紅高糖DMEM稀釋，配制成濃度128 μmol/L的母液，過濾除菌后-20℃避光保存。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步確定的濃度范圍，將母液倍比稀釋，配制濃度分別為12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 μmol/L甲基蓮心堿溶液，分裝于無菌離心管中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性及藥物最適濃度 人皮膚成纖維細(xì)胞以1×104/孔的濃度接種在96孔板中，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度Nef的DMEM溶液 100 μl，每個濃度組設(shè)5個復(fù)孔，孵育24 h，然后向每孔加入50 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩 5min。用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD490 nm處測量各孔的吸光值，空白試劑孔調(diào)零，重復(fù)測量3次，處理數(shù)據(jù)，計(jì)算出各組細(xì)胞的增殖活性。根據(jù)細(xì)胞活性檢測結(jié)果選擇出三組合適的藥物濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組：不使用甲基蓮心堿及紫外線干預(yù)；模型組：僅接受UVA+UVB照射；藥物組：UVA+UVB照射后加不同濃度Nef。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)確定的3個最適濃度，將藥物組分為3個不同濃度組。

6 紫外線照射 人皮膚成纖維細(xì)胞接種至100 mm ×20 mm大小培養(yǎng)皿中，生長至80%～90%融合時(shí)棄去培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，PBS清洗2遍后換以少量不含胎牛血清的DMEM覆蓋細(xì)胞，模型組及藥物組放置在紫外線燈箱內(nèi)，紫外線光源由2個UVA和1個UVB燈管組成，我們選取輻射劑量UVA為20J/cm2以及UVB為40mJ/cm2，輻射距離為15 cm，對照組同時(shí)放置在燈箱外相似環(huán)境下，照射完后棄去培養(yǎng)液，對照組及模型組換以不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，藥物組換以三組含不同濃度的Nef的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

7 光學(xué)顯微鏡和透射電鏡細(xì)胞樣品制備 光鏡樣品制備：細(xì)胞分組處理完后立即換以含不同濃度Nef的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS清洗后直接用于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；電鏡樣品制備：細(xì)胞分組處理完后立即換以含不同濃度Nef的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS清洗細(xì)胞3遍，用2.5%戊二醛固定液中4℃固定2 h，用PBS 浸洗30 min，再用1%四氧化鋨固定液在4℃固定2 h，然后用PBS浸洗10 min。用梯度濃度(30%、50%、70%、90%、100%)的乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷置換10 min，然后用包埋劑將樣品進(jìn)行包埋，最后制作超薄切片(50～70 nm)，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，制備出電鏡樣品，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并拍照。

結(jié) 果

1 Nef對細(xì)胞增殖活性的影響及最適藥物濃度的選擇 以含不同濃度甲基蓮心堿(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞24h，通過MTT實(shí)驗(yàn)來分析Nef對成纖維細(xì)胞的增殖活性的影響。結(jié)果顯示(圖1)，當(dāng)甲基蓮心堿濃度小于等于3.2 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性隨藥物濃度的增大而呈逐漸上升趨勢，在3.2 μmol/L濃度時(shí)細(xì)胞活性達(dá)到最高，而當(dāng)藥物濃度大于3.2 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性逐漸下降。其中甲基蓮心堿濃度小于等于0.1 μmol/L時(shí)，對人皮膚成纖維細(xì)胞活性沒有顯著影響，與對照組相比，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；當(dāng)濃度在0.2 μmol/L到3.2 μmol/L之間時(shí)，甲基蓮心堿對人皮膚成纖維細(xì)胞活性具有促進(jìn)作用，與對照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；當(dāng)濃度達(dá)到6.4 μmol/L至12.8 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性顯著下降，顯示出細(xì)胞毒性，與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示甲基蓮心堿在較低濃度時(shí)具有促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖作用，當(dāng)濃度增加到一定程度時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此經(jīng)過篩選我們選用中間濃度0.8 μmol/L作為甲基蓮心堿實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1 甲基蓮心堿對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性的影響

2 人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 人皮膚成纖維細(xì)胞接受UVA(20J/cm2)和UVB(40mJ/cm2)照射后加入含0.8μM甲基蓮心堿的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞用于光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。對照組中正常的成纖維細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞密度大且細(xì)胞間連接緊密(圖2A)；模型組中接受紫外線照射的人皮膚成纖維細(xì)胞密度明顯下降，部分細(xì)胞形態(tài)變圓、體積縮小，失去特征性長梭形形態(tài)，細(xì)胞間連接消失，從培養(yǎng)皿上游離下來(圖2B)；用甲基蓮心堿(0.8 μmol/L)處理接受紫外線照射的人皮膚成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞密度沒有明顯減少，大部分細(xì)胞形態(tài)保持其特征性形態(tài)，僅有少量細(xì)胞變圓、皺縮，從培養(yǎng)皿上游離下來(圖2C)。結(jié)果表明，UVA(20J/cm2)和UVB(40mJ/cm2)輻射對細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，甲基蓮心堿對紫外線照射導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化具有顯著的保護(hù)作用，且明顯改善了細(xì)胞增殖活性，與MTT的結(jié)果吻合。

3 人皮膚成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 人皮膚成纖維細(xì)胞接受UVA(20J/cm2)和UVB(40mJ/cm2)照射后加入含0.8 μmol/L甲基蓮心堿的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并制作電鏡樣品，通過透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)變化。正常對照組的成纖維細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞膜完整，線粒體呈規(guī)則的圓形或橢圓形，線粒體嵴完整，基質(zhì)豐富(圖3A)；模型組中經(jīng)UVA和UVB輻射后的成纖維細(xì)胞線粒體腫脹、空泡化，線粒體嵴不規(guī)則、斷裂甚至消失(圖3B)；在藥物組中，經(jīng)過甲基蓮心堿干預(yù)紫外線輻射后成纖維細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)基本完整，胞漿中大部分線粒體形態(tài)基本正常，僅有少量線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化，線粒體嵴部分?jǐn)嗔选⑷芙猓疫@種改變較模型組更輕(圖3C)。由上述結(jié)果可見，與模型組相比甲基蓮心堿處理輻射后的成纖維細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器尤其是線粒體的破壞明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)也有明顯的改善。

圖2 光鏡下紫外線輻射和甲基蓮心堿對人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

圖3 電鏡下紫外線輻射和甲基蓮心堿對人皮膚成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×80000)

討 論

紫外線輻射是環(huán)境中導(dǎo)致皮膚老化的最主要原因，皮膚光老化主要表現(xiàn)為皺紋、皮膚松弛、色素沉著、皮膚粗糙、干燥、毛細(xì)血管擴(kuò)張、脂溢性角化甚至皮膚癌等。紫外線中的UVA和UVB是導(dǎo)致光老化的主要成分，UVA和UVB引起活性氧簇ROS(包括OH、O2-、H2O2及1O2等)生成過多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致皮膚光老化的重要原因[1-3]。因此尋找一種安全有效的抗氧化劑是治療及預(yù)防光老化的重要途徑。

甲基蓮心堿是從蓮子芯中提取出來的生物堿，屬雙芐基異喹啉化合物，具有多種藥理作用，如抗炎、舒張平滑肌、抑制心肌改縮力、抗心律失常、抗高血壓、抗腫瘤、抗多重耐藥性等[8-10]。近年來，甲基蓮心堿的抗氧化作用逐漸引起人們的重視，其抗氧化作用是許多藥理作用的基礎(chǔ)。Wang等給大鼠口服甲基蓮心堿后其肝臟組織內(nèi)羥自由基的水平顯著下降，而SOD和GPx的活性明顯升高[6]。但迄今為止尚未見有關(guān)甲基蓮心堿防治皮膚光老化的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，甲基蓮心堿干預(yù)UV輻射后的成纖維細(xì)胞形態(tài)較僅接受UV輻射的細(xì)胞相比明顯改善，表現(xiàn)在大部分細(xì)胞仍然保持其長梭形的特征性形態(tài)，細(xì)胞密度增加，僅有少量細(xì)胞表現(xiàn)出壞死的形態(tài)。在成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)中我們主要觀察了線粒體的形態(tài)。線粒體是細(xì)胞呼吸的重要場所，細(xì)胞呼吸的過程中產(chǎn)生大量的ATP為細(xì)胞代謝提供能量，是維持機(jī)體正常新陳代謝的重要組成。細(xì)胞呼吸的氧化磷酸化過程中電子傳遞鏈產(chǎn)生的電子漏是內(nèi)源性ROS的主要來源[11]。線粒體是產(chǎn)生自由基的場所因此也最容易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致線粒體DNA氧化損傷及線粒體膜電位受損，引起線粒體功能障礙[11]。以往的研究發(fā)現(xiàn),紫外線可誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞線粒體損傷，表現(xiàn)為線粒體腫脹、嵴斷裂、溶解、空泡化等，而應(yīng)用抗氧化劑可以減輕線粒體損傷[12]。我們在實(shí)驗(yàn)中也觀察到同樣的現(xiàn)象，紫外線輻射人皮膚成纖維細(xì)胞后在電鏡下表現(xiàn)出線粒體腫脹、空泡化，線粒體嵴不規(guī)則、斷裂甚至消失，而加入甲基蓮心堿的細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)基本正常，線粒體嵴清晰可見。之前已有研究提出紫外線照射引起ROS的生成，從而破壞細(xì)胞內(nèi)線粒體，使線粒體DNA產(chǎn)生突變，引起線粒體功能異常，導(dǎo)致線粒體呼吸過程的氧化磷酸化和電子傳遞鏈功能缺陷，同時(shí)由于線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，進(jìn)一步產(chǎn)生大量的ROS又使得線粒體DNA突變，形成惡性循環(huán)[13]。這可能是紫外線導(dǎo)致ROS產(chǎn)生的另一機(jī)制之一，同時(shí)也是ROS導(dǎo)致氧化損傷的又一表現(xiàn)。

我們在電鏡下觀察到的結(jié)果從形態(tài)學(xué)方面提供了甲基蓮心堿對光損傷的人皮膚成纖維細(xì)胞具有保護(hù)作用的證據(jù)，與之前通過檢測氧化損傷指標(biāo)觀察到的甲基蓮心堿對光損傷細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用吻合。但是甲基蓮心堿對線粒體的保護(hù)作用具體是通過哪一種或者哪些機(jī)制實(shí)現(xiàn)，仍需要進(jìn)一步研究確定。

[1] Miyamura Y, Coelho SG, Schlenz K,etal. The deceptive nature of UVA tanning versus the modest protective effects of UVB tanning on human skin[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2011, 24 (1): 136-147.

[2] Kwon OS, Jung SH, Yang BS. Topical administration of manuka oil prevents UV-B irradiation-induced cutaneous photoaging in mice[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013, 2013 (6): 930857.

[3] Jo WS, Yang KM, Park HS,etal. Effect of microalgal extracts of tetraselmis suecica against UVB-induced photoaging in human skin fibroblasts[J]. Toxicol Res, 2012, 28 (4): 241-248.

[4] Rai S, Wahile A, Mukherjee K,etal. Antioxidant activity of Nelumbo nucifera (sacred lotus) seeds[J]. J Ethnopharmacol, 2006, 104 (3): 322-327.

[5] Jung HA, Jin SE, Choi RJ,etal. Anti-amnesic activity of neferine with antioxidant and anti-inflammatory capacities, as well as inhibition of ChEs and BACE1[J]. Life Sci, 2010, 87 (13-14): 420-430.

[6] Wang J, Kan Q, Li J,etal. Effect of neferine on liver ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Transplant Proc, 2011, 43 (7): 2536-2539.

[7] Lalitha G, Poornima P, Archanah A,etal. Protective effect of neferine against isoproterenol-induced cardiac toxicity[J]. Cardiovasc Toxicol, 2013, 13 (2): 168-179.

[8] Gu DF, Li XL, Qi ZP,etal. Blockade of HERG K+ channel by isoquinoline alkaloid neferine in the stable transfected HEK293 cells[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2009, 380 (2): 143-151.

[9] Poornima P, Quency RS, Padma VV. Neferine induces reactive oxygen species mediated intrinsic pathway of apoptosis in HepG2 cells[J]. Food Chem, 2013, 136 (2): 659-667.

[10] 施京紅，丁 輝，董 蕾.甲基蓮心堿對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的影響[J].陜西中醫(yī)，2014，35(4)：502-505，510.

[11] Poljsak B, Dahmane RG, Godic A. Intrinsic skin aging: the role of oxidative stress[J]. Acta Dermatovenerol Alp Pannonica Adriat, 2012, 21 (2): 33-36.

[12] 王小勇, 畢志剛, 王云貴, 等. 人參皂苷和枸杞多糖對UVB誘導(dǎo)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞提早衰老的影響[J]. 中華皮膚科雜志, 2010, 43 (3): 184-187.

[13] Berneburg M, Plettenberg H, Medve-Konig K,etal. Induction of the photoaging-associated mitochondrial common deletion in vivo in normal human skin[J]. J Invest Dermatol, 2004, 122 (5): 1277-1283.

(收稿：2017-01-16)

Effects of neferine on the ultrastrcture of human dermal fibroblast in duced by ultraviolet

Cao Jin,Yang Zhuangqun,Abidullah Khan,et al.Department of plastic Surgery and

Maxillofacial Surgery,the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Objective: This study discussed the effect of Neferine on the ultrastructure of ultraviolet to fibroblasts, and provided experimental basis for skin photoaging treatment. Methods: Human skin fibroblasts photoaging model was established by UVA and UVB radiation. Fibroblasts divided into normal control group, model group(radiated with UVA and UVB only) and treatment group(radiated with UVA and UVB and treated with Nef). Morphological and ultrastructural alterations of fibroblasts following UV irradiation were observed and the impact of Nef on it was explored. Results: Fibroblasts following UV exposure lose its normal shape and ultrastructural analysis also reveals damage to mitochondria; nevertheless, the damage was reduced when treated with Nef. Conclusions:The appropriate concentration of neferine can reduce damage of the ultrastructure of fibroblasts after ultraviolet irradiation, and provide a new method for the prevention and treatment of skin photoaging diseases.

Dermatology Ultraviolet rays Liensinine/theropeutic use Fibroblasts

*陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JQ4151)

皮膚病學(xué) 紫外線 蓮心堿/治療應(yīng)用 成纖維細(xì)胞

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.003

△通訊作者