轉AtNHX1基因馬鈴薯田間鹽脅迫下的生理反應及耐鹽性的綜合評價

李麗霞，劉玉匯，王 麗，余 斌，張俊蓮，王 蒂,3

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室/甘肅農業大學園藝學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學生命科學技術學院， 甘肅 蘭州 730070； 3.甘肅農業大學農學院， 甘肅 蘭州 730070)

轉AtNHX1基因馬鈴薯田間鹽脅迫下的生理反應及耐鹽性的綜合評價

李麗霞1，劉玉匯1，王 麗2，余 斌1，張俊蓮1，王 蒂1,3

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室/甘肅農業大學園藝學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學生命科學技術學院， 甘肅 蘭州 730070； 3.甘肅農業大學農學院， 甘肅 蘭州 730070)

以轉AtNHX1基因的8個馬鈴薯株系(1、2、4、6、8、15、18、19)和未轉基因的“甘農薯2號”(CK)為材料，在正常地以及全鹽含量分別為0.56%、0.29%的高鹽和中鹽地上種植，分析其生長和生理指標的變化，通過隸屬函數法、相關分析和聚類分析等方法綜合評價耐鹽性。結果表明：隨著鹽濃度的增加，轉基因株系的株高、葉面積擴展率、單株產量、葉綠素的含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及脯氨酸含量的上升幅度均高于對照植株(為對照的1.17～3.96倍)。而丙二醛(MDA)、相對電導率顯著低于對照植株，為對照的63.07%～78.4%和82.7%～86.35%。根據生長和生理指標綜合評價各株系的耐鹽性，篩選出1個強耐鹽株系和3個較強耐鹽株系，各株系耐鹽性由強至弱為：19>15>8>4>18>2>1>6>CK，AtNHX1的導入顯著提高了大田馬鈴薯植株的耐鹽性，利用耐鹽性綜合評價方法有助于耐鹽株系的篩選。

馬鈴薯；AtNHX1基因；鹽脅迫；生理參數；耐鹽性評價

土壤鹽堿化是一個世界性的問題，是影響植物生長發育的主要原因之一。馬鈴薯(Solanumtuberosum)作為四大糧食作物之一，屬于鹽敏感型作物，其在鹽漬化土地上生長發育受阻。我國是馬鈴薯生產大國，種植面積和產量均占世界的23%～28%，均居世界第1位[1]。鹽脅迫下作物吸水困難，使細胞組織的水分外滲，種子萌發和幼苗的生長受到抑制；由于作物體內水分虧缺，進而光合作用下降，能耗增加，衰老加速，生長量降低，更為嚴重者導致植株死亡[2]。隨著分子生物學與基因工程技術的日趨成熟和迅猛發展，通過基因工程手段改良作物的耐鹽性已被廣泛關注和重視。

擬南芥AtNHX1基因是克隆得到的第一批植物Na+/H+逆向轉運蛋白基因之一，其具有將Na+區隔化于液泡的功能，起到細胞質Na+解毒、調節滲透壓和平衡離子的作用[3]。研究表明將AtNHX1基因轉化至番茄[4]，小麥[5]、棉花[6]、大豆[7]等農作物以及楊樹[8]等喬木，可顯著增強轉基因植株在鹽逆境脅迫下的抗鹽能力。在轉AtNHX1馬鈴薯的耐鹽性研究中，王麗[9]運用農桿菌介導法成功地將AtNHX1導入馬鈴薯，證明AtNHX1基因整合到馬鈴薯的基因組中并進行轉錄，之后崔炎森[10]對8個轉AtNHX1株系進行了盆栽耐鹽性鑒定，發現轉基因植株的耐鹽性顯著強于對照。許多研究從馬鈴薯生長指標如株高、葉面積、塊莖產量以及葉綠素、脯氨酸、丙二醛等生理指標作為鑒定評價馬鈴薯耐鹽性，但是單項指標難以全面、準確地評價耐鹽性，尤其對于如何綜合評價田間馬鈴薯耐鹽性尚未見報道。本研究以大田種植的轉AtNHX1基因馬鈴薯和未轉基因馬鈴薯為材料，將相關生長與生理指標通過隸屬函數法、相關性分析法、聚類分析法來綜合評價耐鹽性，以期為馬鈴薯的改良及耐鹽性的綜合評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為馬鈴薯栽培品種“甘農薯2號”(CK)和以該品種為受體材料的轉AtNHX1基因的8個株系，其編號為1、2、4、6、8、15、18、19。

1.2 試驗處理

1.2.1 土樣分析 以甘肅省景泰縣條山農場的鹽堿地作為試驗田。試驗區采用五點法取土樣(0～20 cm深)。土壤pH值和全鹽量由甘肅省農科院測試分析室采用pHS-25型酸度計和DDS-12A數顯電導率儀進行測定。測定結果：高鹽地、中鹽地、正常地全鹽量分別為0.56%、0.29%、0.17%；pH值分別為8.52、8.32、8.08。

1.2.2 種植方法 大小一致(約40～50 g)的健康轉基因植株和對照植株的薯塊，隨機播種于高鹽、中鹽和正常地的試驗區中，每個株系在各試驗區內種植120株，重復3次。栽培管理措施遵循當地管理方法。

1.3 指標的測定及其方法

植株生長至50 d時測定其株高、葉面積、葉綠素、相對電導率、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、脯氨酸。生長90 d后測定單株產量。

1.3.1 生長指標測定 每處理選取10株測定植株高度；葉面積利用方格法，葉面積擴展率=葉面積/天數(d)；單株產量采用稱重法。

1.3.2 生理生化指標測定 葉綠素含量采用丙酮乙醇混合提取法[11]，脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法[12-13]；相對電導率采用電導法，丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法以及超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑法[12]。

1.4 數據處理及分析

所得數據采用Microsoft Excel 和SPSS13.0軟件進行統計分析。

利用如下公式分別計算單項指標耐鹽系數、綜合耐鹽系數、耐鹽指數、隸屬函數值、耐鹽性量度值：

單項指標耐鹽系數PI=(不同濃度處理下的平均測定值/對照測定值)

(1)

綜合耐鹽系數

(2)

耐鹽指數

(3)

隸屬函數值

(4)

(5)

標準差系數

(6)

權重系數

(7)

耐鹽性量度值

(8)

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對馬鈴薯株系生長特性的影響

鹽脅迫下馬鈴薯株系生長受到抑制(圖1A)。隨著鹽濃度的升高，轉基因植株和CK植株株高均呈下降趨勢，但轉基因植株下降程度較小。正常條件下，轉基因株系株高較對照平均升高了19.83%，其中15、18和19號株系與對照間差異顯著(P<0.05)。中鹽條件下，1、4、6、15和19號轉基因株系株高均顯著(P<0.05)高于CK。高鹽脅迫下轉基因株系平均株高為CK的1.5倍，除1號、6號和15號轉基因株系，其它株系均與CK呈顯著差異(P<0.05)。

圖1 鹽脅迫下生長指標的變化

鹽脅迫下馬鈴薯各株系葉面積擴展率也隨著鹽濃度的升高而降低(圖1B)。在同一鹽脅迫下，大部分轉基因株系與CK間的差異顯著(P<0.05)。中鹽條件下，轉基因株系較正常處理平均下降了19%，但其葉面積平均擴展率(除1和6號株系外)是CK的2.55倍，差異達到極顯著(P<0.01)水平。高鹽脅迫時，轉基因植株的葉面積擴展率是CK的1.75～3.73倍。

鹽脅迫對單株產量影響較大(圖1C)。正常條件和中鹽脅迫條件下，轉基因植株單株平均產量均顯著(P<0.05)高于CK，較CK分別提高了39.28%～79.77%和61.97%～103.58%，高鹽脅迫下，平均產量較CK提高了48.24%～254.67%，其中2、4、15和19號株系單株產量較CK顯著增加2.17%、1.83%、1.48%和2.55%(P<0.05)。

2.2 鹽脅迫對馬鈴薯株系生理指標的影響

隨鹽濃度的增加，對照和轉基因株系中葉綠素含量均明顯降低，但轉基因株系下降幅度明顯小于對照(圖2A)。正常地中，轉AtNHX1植株的葉綠素含量顯著高于CK(P<0.05)；中鹽脅迫下，轉基因株系葉綠素含量較CK高35.59%～75.57%，其中19號株系的葉綠素含量是CK的1.76倍(P<0.05)；高鹽脅迫下，對照植株的葉綠素含量由1.35 mg·g-1下降至0.99 mg·g-1，下降幅度達34.71%，而轉基因株系較未脅迫時平均下降了11.71%，其中4、18和19號株系葉綠素含量為1.69 mg·g-1、1.57 mg·g-1和1.66 mg·g-1，分別是對照的1.68倍、1.57倍和1.66倍，說明外源AtNHX1基因的導入，減弱了對葉綠素含量的影響，其中株系4，18和19的耐鹽性強。

鹽脅迫下脯氨酸含量隨著鹽濃度的升高而升高(圖2B)。正常地中轉基因植株脯氨酸含量較CK低12.61%～52.7%，中鹽條件下各株系脯氨酸含量均顯著(P<0.05)增高，但各株系間差異不顯著；高鹽脅迫下，對照脯氨酸含量為轉基因株系的1.14～1.49倍，且高鹽下的脯氨酸含量均顯著高于中鹽下的處理。盡管轉基因株系脯氨酸含量低于對照，但較正常處理下，中鹽和高鹽脅迫下轉基因株系脯氨酸含量的上升幅度分別為66.28%～214.3%和175.14%～288.49%，而對照植株脯氨酸的上升幅度為54.07%和173.4%，說明轉基因植株在鹽脅迫下脯氨酸積累快。

鹽脅迫使馬鈴薯葉片細胞膜結構受到損傷，膜通透性增加，相對電導率增加。隨著鹽脅迫的程度加劇，不同馬鈴薯株系相對電導率增加的幅度差異較大。結果顯示，轉基因馬鈴薯細胞膜損傷程度較小，相對電導率增加的速率低于未轉基因植株(圖2C)。膜結構的損傷引起膜脂過氧化反應加劇，過氧化產物MDA積累。如圖2D，馬鈴薯各株系中MDA含量隨著鹽濃度的升高積累量增多。在正常與中鹽條件下，大部分轉AtNHX1株系中MDA含量與CK達到顯著性差異(P<0.05)；高鹽脅迫時，轉基因株系和CK的MDA積累量較正常地分別增加了47.44%和15.80%，與CK呈顯著性差異(P<0.05)。由圖2E可知隨鹽濃度升高馬鈴薯植株的SOD活性均呈上升趨勢。在同一處理下轉AtNHX1植株內SOD活性均高于CK，中鹽和高鹽條件下轉AtNHX1植株的SOD酶活性分別是CK的1.15～1.40倍和1.09～1.19倍。

2.3 轉AtNHX1馬鈴薯的耐鹽性評價

2.3.1 鹽脅迫下馬鈴薯株系各指標的耐鹽性分析 對照與8個轉基因株系的單項指標耐鹽系數如表1。結果顯示，馬鈴薯株系間各項指標的耐鹽系數變化趨勢并不一致，如CK的丙二醛的耐鹽系數最大，而轉基因株系4號葉綠素的耐鹽系數最高，18號SOD的耐鹽系數最大。這種差異程度說明僅用單項指標難以準確地進行馬鈴薯耐鹽性評價，運用多指標進行綜合評價才更加科學合理，從而能夠綜合評價出耐鹽性較強的株系。如表1所示，盡管單一指標下耐鹽系數不同，但轉基因株系的綜合耐鹽系數均高于CK，說明轉AtNHX1株系的耐鹽性強。

盡管單項指標難以真正地反映植株的耐鹽性，但其在植株耐鹽逆境生長中占據著重要作用。為了解各指標對耐鹽性的敏感性，參照連續變數的次數分布統計方法，將測試各性狀的耐鹽系數以組距為0.25分成7個組區間，制作成次數分布表。由表2可看出，在同一組區間各性狀的耐鹽系數分布次數相差較大，如100%的葉面積擴展率和葉綠素含量的耐鹽系數PI[0.75，1)，88.9%的MDA和SOD耐鹽旱系數PI[1，1.25)，66.7%的脯氨酸的耐鹽系數PI>2，說明各指標對鹽脅迫的敏感程度不同，株高、單株產量、葉綠素以及脯氨酸含量等對鹽脅迫非常敏感。

進一步以各指標的耐鹽系數為依據，對其進行標準化處理，以歐式距離的平方為相似尺度，采用離差平方和法對數據進行聚類分析，結果如圖3所示。根據聚類結果，可將馬鈴薯各株系的耐鹽性分為5大類。第一類為轉基因19號，耐鹽性最強；第二類轉基因株系8號、18號、15號耐鹽性也較強；第三類為中等耐鹽性轉基因株系2號和6號；第四類是具有耐鹽性弱的轉基因株系1號和4號；第五類是未轉基因株系CK，耐鹽性差。由此可以看出，轉基因株系間耐鹽性強弱存在較大差異，但是轉AtNHX1基因的8個株系的耐鹽性均強于對照CK。

圖2 鹽脅迫下生理生化指標的變化

2.3.2 隸屬函數和標準差系數賦予權重法分析馬鈴薯各株系的耐鹽性 運用模糊數學隸屬函數公式對各指標進行標準化處理，并且利用標準差系數賦予權重法對各指標賦予權重從而定量地比較株系間的耐鹽能力。根據公式(3)～(8)計算相應的隸屬函數值，耐鹽性量度值，綜合耐鹽指數；根據耐鹽指數與權重計算加權耐鹽指數(表3)。可看出各株系綜合評價指標的變化趨勢并不一致，但19號轉基因株系的各項指標都最高，CK最低，總體上轉基因株系的各項值都高于對照CK，表明轉基因株系的耐鹽性強。表中的耐鹽性量度值D代表了各株系的耐鹽性，以其對各株系進行耐鹽性排序，結果可知各株系耐鹽性19>15>8>4>18>2>1>6>CK。這與聚類分析的結果存在差異，也許是各指標的權重不同所造成的。權重結果見表4。

表1 鹽脅迫下綜合評價指標的耐鹽系數

注：**、*分別表示0.01和0.05水平差異顯著性。

Notes: **, * indicate significant difference atP<0.01 andP<0.05 level, respectively.

表2 供試材料各性狀指標的耐鹽系數在不同區間的分布

表3 耐鹽性綜合評價

圖3 聚類分析

進一步對耐鹽性量度值D和各指標的耐鹽系數的隸屬函數值進行相關分析。分析結果以及各指標的權重如表4所示。結果顯示耐鹽性量度值D與株高，葉面積擴展率、單株產量、葉綠素含量、相對電導率耐鹽系數隸屬函數值的相關性均達到極顯著水平，與MDA、SOD間的在5%的水平上達到顯著差異性。耐鹽性量度值D既考慮各指標的重要性，又考慮了各指標間的相互關系，因此，用耐鹽性量度值綜合評價耐鹽性較為全面和準確，可全面反映各株系的耐鹽性。

表4 各指標隸屬函數與耐鹽性度量值D相關分析以及各指標的權重

3 討 論

3.1 馬鈴薯耐鹽性的評價指標

作物的抗逆性不僅是一個受多種因素影響的復雜的數量性狀，且不同品種的抗逆機制也不盡相同，從而使不同品種在逆境條件下對某一具體指標的反應也不相同[14]。形態變化是植物受到逆境脅迫最直接的反映[15]。植株在鹽脅迫下由于碳同化量減少、滲透調節能耗和維持生長能耗增加等原因，導致植株生長量減少[16]。本研究中，馬鈴薯各株系的株高、葉面積擴展率以及單株產量均隨著鹽脅迫程度的加劇而下降，轉AtNHX1馬鈴薯株系的生長指標均高于未轉基因CK株系。耐鹽性綜合分析中相關分析表明，株高、葉面積擴展率以及單株產量均與耐鹽性的綜合度量值D達到極顯著相關性。

植物在鹽脅迫下鹽敏感性不同表現出不同的生理變化[17]。葉綠素作為綠色植物進行光合作用的主要色素，其含量的穩定有利于植株在脅迫下維持正常的光合作用，從而增強植株對鹽脅迫的耐受能力[18]。本研究表明，馬鈴薯各株系中的葉綠素的含量隨著鹽濃度的增加而下降，但是轉基因株系中的葉綠素含量普遍高于CK，因此在鹽脅迫下轉基因株系中葉綠素的合成沒有受到抑制或抑制性較弱，其含量相對較穩定，進而使得轉基因馬鈴薯株系耐鹽性較強。脯氨酸在鹽害條件下的積累起到了胞質滲透壓調節劑的作用，保護膜與酶的結構，緩解鹽脅迫壓力[19-20]。周廣生、李源等研究發現脯氨酸的積累量與植株耐鹽性呈負相關[20-21]，且李源等研究認為脯氨酸含量積累的高低不能反映植株的耐鹽程度，而脯氨酸積累的快慢能體現其對鹽脅迫的敏感程度，可作為植物耐鹽性鑒定的評價指標[21]。本研究結果顯示隨鹽濃度的增加，馬鈴薯各株系脯氨酸含量均上升，但是在中鹽和高鹽脅迫下，轉基因株系中脯氨酸含量的上升幅度分別是對照植株脯氨酸積累幅度的1.23～3.96倍和1.17～1.66倍。說明鹽脅迫下轉基因株系細胞通過快速積累脯氨酸來調節細胞內的滲透勢，維持水分平衡，保護細胞內代謝所需的酶活性，其耐鹽性強于對照植株。

鹽脅迫后，植物體內活性氧產生和清除的動態平衡被破壞，活性氧水平上升導致MDA大量積累，造成膜脂的過氧化和脫脂化作用，膜蛋白受損，細胞結構損傷[22-23]。SOD是活性氧清除反應過程中第一個發揮作用的抗氧化酶，在氧化酶類中處于核心地位[24]。而SOD作為植物內源自由基清除劑，是一種重要的抗氧化劑，在逆境中SOD酶活性增強或維持較高的水平，可清除活性氧自由基，維持細胞膜的穩定性和完整性，從而提高植物在逆境中生存能力[25]。且有學者認為在逆境條件下，植物的抗性與植物體內能否維持較高的SOD的水平有關，SOD水平的高低在一定程度上反映了植物耐逆本領的強弱[24,26]。夏民旋等[26-27]認為利用SOD與逆境脅迫的關系，對不同植物進行不同的逆境脅迫試驗，可了解不同植物對逆境的反映，進一步對培育新品種以及農業生產提供參考。本研究表明鹽脅迫下MDA的積累量、相對電導率以及SOD均隨著鹽濃度的增加而增加，其中在同一條件下轉基因株系中MDA與相對電導率均低于CK，而SOD在轉基因株系中顯著高于未轉基因植株。由此可知導入AtNHX1基因可維持細胞膜的穩定性，增強SOD活性，減弱膜脂過氧化，使馬鈴薯植株維持正常的生長代謝狀態。

3.2 馬鈴薯耐鹽性評價方法

植物的耐鹽生理過程復雜，對任何單項機理的研究都不能全面、準確地評價植物耐鹽性[28]。本研究結果顯示，參試馬鈴薯各株系的各項指標的耐鹽系數變化趨勢并不一致，不同株系某一具體指標的耐鹽性反應也不一定相同。因此，用單一指標難以全面、準確地反映參試株系耐鹽性的強弱。目前隸屬函數法、相關分析以及聚類分析等方法將各指標相結合的耐鹽性綜合評價已在植株抗逆性評價中應用較多[29]。模糊數學隸屬函數法消除了單一指標帶來的片面性，使參試株系間的耐鹽性差異具有可比性，是一種比較可靠的評價方法。用隸屬函數法、相關分析法得到耐鹽性度量值D值不僅考慮了各指標間的相互關系，又考慮到各指標的重要性，根據D值的大小可以較準確地評價馬鈴薯的耐鹽性。加權耐鹽指數也可從多個指標中篩選出最重要的指標，對不同指標根據其權重大小衡量品種耐鹽性。本研究通過聚類分析、隸屬函數和標準差系數賦予權重法、相關分析相結合的方法將8個生長和生理指標進行分析，并且篩選出參試馬鈴薯各株系的耐鹽性強弱關系：19>15>8>4>18>2>1>6>CK。并從表2和表4可以看出，與生長指標相同，葉綠素、脯氨酸、相對電導率、MDA、SOD與馬鈴薯耐鹽性具有顯著相關性(P<0.05)，其中葉綠素、脯氨酸、相對電導率與馬鈴薯耐鹽性呈極顯著相關性(P<0.01)，并且這些指標在鹽脅迫下均具有敏感性，能夠很好地反映材料間的耐鹽性，因此可直接作為耐鹽評價的鑒定。

綜上所述，AtNHX1作為液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白表達基因，其能夠顯著提高田間馬鈴薯植株的耐鹽性，所獲得的高耐鹽轉基因株系將為今后馬鈴薯耐鹽育種提供種質資源。

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Acomprehensiveevaluationofsalt-toleranceandphysiologicalresponseoftransgenicpotatotosaltstressinfieldbytheintroductionofAtNHX1gene

LI Li-xia1, LIU Yu-hui1, WANG Li2, YU Bin1, ZHANG Jun-lian1, WANG Di1,3

(1.GansuKeyLaboratoryofCropGeneticandGermplasmEnhancement/CollegeofHorticulture/GansuKeyLaboratoryofAridlandCropScience,Gansu,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofLifeSciencesandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Gansu,Lanzhou730070,China; 3.CollegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Gansu,Lanzhou730070,China)

This study investigated the morphological and physiological traits of eight transgenic potato (SolanumtuberosumL.) lines carryingAtNHX1 gene and one non-transgenic control “Gannongshu No.2” grown on normal soil and saline land at 0.56% salt and 0.29% salt concentration. The salt tolerance of transgenic potato was evaluated using a comprehensive evaluation method including subordinate function, correlation analysis and cluster analysis. The result showed that with the increase of salt concentration the plant height, leaf area expansion rate, yield per plant, chlorophyll content, activity of SOD and the rising range of proline content of transgenic lines were higher 1.17～3.96 times than that of the control. However, the increasing degree of MDA, relative conductivity of transgenic lines was significant lower than that of control, only 63.07%～78.4% and 82.7%～86.35% of the control. A transgenic potato line with highest salt tolerance and three transgenic lines with higher salt tolerance were screened out according to the comprehensive evaluation on the morphological, physiological and biochemical parameters. The transgenic lines with different degree of salt tolerance were as follows: 19>15>8>4>18>2>1>6>CK. The result concluded that the salt tolerance of transgenic potato grown in field can be improved by introducingAtNHX1 gene, and the comprehensive evaluation method can be used to screen out transgenic potato with high salt tolerance.

potato;AtNHX1 gene; salt stress; physiological parameter; comprehensive evaluation of salt tolerance

1000-7601(2017)03-0130-08doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2017.03.21

2016-04-27

：2017-03-28

：國際科技合作專項項目(2014DFG31570)；甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目(GNSW-2015-15)；國家現代農業產業技術體系建設項目(CARS-10-P18)；甘肅省高等學校基本科研業務費(GSKYYWF-1)

李麗霞(1990—)，女，甘肅定西人，碩士研究生，研究方向為蔬菜生理與栽培技術。 E-mail：867463408@qq.com。

劉玉匯，女，甘肅臨潭縣人，主要從事馬鈴薯遺傳育種及栽培生理研究。 E-mail：lyhui@aliyun.com。 張俊蓮，女，山西代縣人，主要從事馬鈴薯遺傳育種及栽培生理研究。 E-mail：zhangjunlian77@163.com。

S532

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