人類胚胎干細胞來源的心肌細胞模型的建立及系統鑒定方案

陳欣欣,劉珠媛,顧寰宇,周蕾

(南京醫科大學第一附屬醫院心臟內科,南京 210029)

?精準與轉化醫學?

人類胚胎干細胞來源的心肌細胞模型的建立及系統鑒定方案

陳欣欣,劉珠媛,顧寰宇,周蕾

(南京醫科大學第一附屬醫院心臟內科,南京 210029)

心肌細胞是研究心血管疾病的重要工具之一,但是人類心肌細胞較難獲得和培養.為人類胚胎干細胞誘導分化成心肌細胞提供一個有用的實驗方法和鑒定方案.人胚胎干細胞以其多向分化的特性為體外研究提供了細胞資源.在人胚胎干細胞誘導分化為心肌細胞的過程中,通過熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測發現,在分化過程中干細胞標記物Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2和Nanog表達下降,心肌特異性結構蛋白cTnT和α-actinin以及心臟前體細胞分化標記物Nkx2.5表達上升.分化完成后用免疫熒光檢測心肌特異性結構蛋白TnnT2和α-actinin,通過分析TnnT2陽性細胞的比例, α-actinin陽性細胞的比例,以及TnnT2和α-actinin雙陽性細胞的比例發現,在所提出的胚胎干細胞誘導分化體系中,三者比例分別為90.80%,91.00%,90.91%,表明在此誘導分化條件下人胚胎干細胞可成功分化成為心肌細胞.成功建立了人胚胎干細胞來源的心肌細胞模型以及基于標記物熒光定量PCR及免疫熒光系統檢測的鑒定方案,為未來心血管疾病的基礎研究及心臟毒性藥物檢測奠定了一定的基礎.

人胚胎干細胞;細胞分化;心肌細胞

心血管疾病已成為21世紀人類健康的首要殺手,針對心血管疾病的基礎研究是研發此類疾病治療方法的基本手段.但遺憾的是,人類心肌細胞的獲取和培養都極其困難,而基于人類心肌細胞的研究相較大鼠心肌細胞更有助于模擬人類心血管疾病.人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有分化全能性,可誘導分化為心肌細胞[1-3].分化后的心肌細胞在形態結構[4]、基因表達[5]、電生理特性[6]、離子通道[7]等特征上均和人體內心肌細胞相同.隨著胚胎干細胞技術的發展,人胚胎干細胞可以被誘導生成人類心肌細胞,但是缺乏簡單可靠的方案[8-9].

近年來,人胚胎干細胞在藥物研發及藥物安全性評價研究中的作用越來越受到人們的重視[9-10],美國國家研究委員會提出的“21世紀毒性測試新策略”將基于人胚胎干細胞的新的藥物心臟毒性評價模型納入其中[11],歐洲替代法驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods,ECVAM)也正式批準胚胎干細胞為體外藥物和化合物毒性篩選的替代方法,并制定了相應的評價標準[12].但是,進行藥物心臟毒性研究時采用人胚胎干細胞誘導的人類心肌細胞效果更佳.此外,開發人胚胎干細胞來源的心肌細胞可避免動物模型的種屬差異,縮短研發周期,降低模式動物的消耗,減少研發費用,是大規模篩選心臟疾病相關藥物的理想手段[13].但遺憾的是,目前人胚胎干細胞向心肌細胞分化的比率并不高[14],且對于分化完成后心肌細胞的鑒定方案單一,局限于鏡下觀察或對少量標記物的檢測,缺少系統完善的鑒定體系[15-17].本實驗對在體外定向誘導人胚胎干細胞向心肌細胞的分化方法進行了優化,并對干細胞相關標記物和心肌細胞標記物進行鑒定,建立了一種人類胚胎干細胞分化為心肌細胞的優化方法,同時為該來源的心肌細胞模型建立提供了系統的評價方法,為更好地服務體外心臟毒性實驗、心肌細胞實驗等研究提供一定的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎干細胞購自Wicell公司.

人胚胎干細胞的培養及分化：DMEM/F12,RPMI1640/B27,胎牛血清,8 000 U/mL青霉素和8 mg/mL鏈霉素混合液,0.25%Trypsin-EDTA(1X)購于Gibco公司,CHIR99021(GSK3抑制劑)和IWP2(Wnt抑制劑)購于Selleck公司,堿性成纖維細胞生長因子/bFGF購于Peprotech公司.

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)及熒光定量PCR相關試劑：trizol購于Takara公司,反轉錄試劑盒購于BioRad公司,PCR引物購于華大基因公司,SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購于BioRad公司,96/384孔熒光定量PCR板及配套貼膜購于Abcam公司.

免疫熒光檢測相關試劑：載玻片購于南通天盛公司,免疫熒光用特異性單克隆一抗TnnT2,α-actinin購于Abcam公司,熒光二抗購于Jackson公司,Hoechst購于凱基公司.

1.2 方法

1.2.1 人胚胎干細胞的培養

人胚胎干細胞飼養于小鼠滋養層細胞上,且用添加堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,4 ng/mL)的無血清培養基(DMEM/F12+20%KSR)進行培養.待人胚胎干細胞克隆長至足夠大小后(大約5 d),吸去培養基,用DMEM/F12洗一遍,然后加入1 mL Dispase于37?C消化3 min,再次加入DMEM/F12,洗一遍后吸去Dispase和DMEM/F12.后用移液管將人胚胎干細胞克隆機械分割成直徑約200μm的細胞團塊, 100×g離心1 min.用含有bFGF的培養基重懸至小鼠滋養層細胞(預先用DMEM/F12洗去小鼠滋養層細胞培養基中的血清)上.次日,全換液,接下來每天換液時留下前一天的0.5 mL培養液(以保留少量滋養層細胞分泌的細胞因子).等到第五天左右傳代.

1.2.2 人胚胎干細胞向心肌細胞的定向誘導分化

人胚胎干細胞向心肌細胞定向誘導分化前一天傳代時,將細胞克隆機械分割成100～150μm的細胞團塊.第五天,提前3 h用rock抑制劑Y27632(5μmol/L)處理,后吸去培養基,先用2 mL 0.05%Trypsin清洗,中和殘余培養基,再加入2 mL 0.05%Trypsin,于37?C消化3 min,吸去Trypsin后置于37?C再消化3～5 min,直至大部分細胞克隆消化成單細胞.然后用培養基重懸,50×g離心30 s去除未消化成單細胞的細胞團塊.取上清液1 000×g離心2 min,去上清液用培養基重懸洗滌2次后計數.用含5μmol/L rock抑制劑Y27632和4 ng/mL bFGF的3 mL培養基,將40～60萬細胞接種于鋪有低密度滋養層細胞的6孔板(預先用DMEM/F12洗去小鼠滋養層細胞培養基中的血清)中.第五天處理后每天換液,換液時不添加Y27632.第八天換液時用3 mL含12μmol/L CHIR99021(GSK3抑制劑)的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養基,以便誘導人胚胎干細胞形成中胚層細胞.第九天,用不含CHIR99021的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養基.第十天換成3 mL含5μmol/L IWP2(Wnt抑制劑)的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養基,以便誘導形成心肌中胚層.第十二天后,用不含IWP2的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養基.

1.2.3 免疫熒光

將分化完成的人胚胎干細胞以20萬/mL鋪于24孔板.將培養基吸棄,用4%多聚甲醛固定15 min,0.5%Triton X-100破膜25 min,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉1 h.用5%BSA稀釋一抗：α-actinin(1∶200),TnnT2(1∶100),4?C孵育過夜.次日,吸棄抗體孵育液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗,用5%BSA配制相應熒光二抗(1∶200),室溫避光孵育2 h.PBS清洗,用Hoechst染細胞核.最后,每孔加入100μL PBS,于熒光顯微鏡下拍照.

1.2.4 熒光定量PCR檢測

采用熒光定量PCR檢測Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2,Nanog,cTnT, α-actinin和Nkx2.5的表達,引物序列如表1所示.

從培養箱中取出6孔板,在每孔中加入700μL Trizol,裂解3 min,室溫放置5 min,收集每孔的裂解到1.5 mL離心管中,在每個離心管中加入140 mL氯仿,渦旋30 s,室溫放置3 min,4?C,12 000×g離心15 min,Trizol∶氯仿=5∶1(體積比),吸取上層無色水相到新的1.5 mL離心管中,加入等體積異丙醇混勻,室溫放置10 min,在管底可見微量RNA沉淀,棄上清,加入75%乙醇700μL(75%乙醇用DEPC水配),4?C,7 500×g離心10 min,棄上清液,通風櫥內干燥5～10 min,將沉淀溶于20μL DEPC水中,測RNA濃度.逆轉錄反應體系如下：5×iScript Reaction mix 4μL,iScript Reverse Transcriptase 1μL,總RNA 2.0μg, Nuclease free H2O的體積為7.5μL減去RNA體積,逆轉錄成cDNA.利用合成的cDNA和對應的PCR引物檢測目的基因的表達水平.

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 統計方法

運用SPSS21.0軟件進行統計學分析.選用單因素方差分析進行組間比較,并以Bonferroni作兩兩比較.P<0.05表示有統計學差異.

2 結果

2.1 干細胞相關基因表達變化

分別在分化的0,1,5,8 d用熒光定量PCR檢測干細胞相關基因Cripto,Dnmt3b,Wnt3, KIF4,Oct4,SOX2,Nanog,結果顯示,在分化過程中上述基因表達依次下調,說明在本工作的分化體系下,干細胞逐漸失去干性,開始分化(見圖1).圖1中,相對于0 d,?為P<0.05,??為P<0.01,???為P<0. 001;相對于1 d,#為P<0.05,##為P<0.01,##為P<0. 001;相對于5 d,$為P<0.05,$$為P<0.01,$$$為P<0.001,n=4.

2.2 心肌細胞相關基因的表達

分別在分化的0,1,5,8 d用熒光定量PCR檢測心肌特異性結構蛋白cTnT和α-actinin,以及心臟前體細胞分化標記物Nkx2.5.結果顯示,在分化過程中,cTnT,α-actinin和Nkx2.5表達逐漸上升,說明人類胚胎干細胞逐漸向心肌細胞分化(見圖2).

在分化完成的胚胎干細胞中,運用免疫熒光檢測心肌特異性結構蛋白TnnT2和α-actinin(見圖3),通過分析TnnT2陽性細胞的比例,α-actinin陽性細胞的比例,以及TnnT2和α-actinin雙陽性細胞的比例發現,在本工作提出的胚胎干細胞誘導分化體系中,三者比例分別為90.80%,91.00%,90.91%(見圖4).

圖1 熒光定量PCR檢測人胚胎干細胞干性相關基因Fig.1 Fluorescent quantitative PCRs determines genes related to pluripotency state of hESCs

圖2 熒光定量PCR檢測心肌細胞分化標志物Fig.2 Fluorescent quantitative PCRs determines markers of cardiomyocytes differentiation

圖3 免疫熒光檢測心肌特異性結構蛋白TnnT2和α-actininFig.3 Immunofluorescence stainings for TnnT2 and α-actinin

圖4 免疫熒光檢測人胚胎干細胞分化效率Fig.4 Immunofluorescence stainings for the differentiation efficiency

3 討論

人胚胎干細胞具有多向分化的能力,在不同的誘導條件下可以分化為神經細胞、成骨細胞、脂肪細胞和心肌細胞等多種細胞,在體外可長時間培養、傳代.本工作在既往研究的基礎上總結經驗,成功建立了一種將人類胚胎干細胞分化為心肌細胞的優化方法,并建立了全面系統的鑒定體系.

通過熒光定量PCR檢測人胚胎干細胞在誘導分化后干性基因和心肌分化標志物基因的表達情況.結果表明,Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2,Nanog是未分化人胚胎干細胞中特異表達基因.這些基因經誘導后在人胚胎干細胞的表達逐漸下降,提示人胚胎干細胞不再維持自身的未分化狀態,而細胞逐漸分化并失去干性.Nkx2.5在心肌發育過程中發揮關鍵性作用,是心臟前體細胞特異性表達的重要轉錄因子,其激活常常意味著心肌細胞分化程序的啟動.熒光定量PCR結果顯示,人胚胎干細胞經過誘導后,Nkx2.5表達并逐漸升高,說明心肌細胞的分化程序已被啟動.cTnT和α-actinin是心肌特異性結構蛋白,同樣在誘導后表達逐漸升高,這提示在本工作的誘導分化模型中，人胚胎干細胞已被定向分化為人心肌細胞.通過對干細胞標記物表達和心肌細胞標記物表達兩方面的動態檢測,對人源性胚胎干細胞分化成心肌細胞進行了驗證.

為了進一步證實本工作提出的細胞分化體系可以獲得成熟的人心肌細胞,用免疫熒光方法檢測了分化完成的細胞.通過分析TnnT2陽性細胞的比例,α-actinin陽性細胞的比例,以及TnnT2和α-actinin雙陽性細胞的比例發現,在優化后的胚胎干細胞誘導分化體系中,三者比例分別為90.80%,91.00%,90.91%.通過熒光定量PCR和免疫熒光兩種檢測方式對人源性胚胎干細胞分化成心肌細胞進行了驗證.基于此,本工作建立了對人胚胎干細胞誘導分化的過程中心肌細胞標記物和干細胞標記物兩方面驗證;并在分化完成后對心肌細胞標記物和干細胞標記物通過熒光定量PCR和免疫熒光兩種檢測方式驗證系統鑒定方案.

人胚胎干細胞可以在不同的誘導條件下分化成各種類型的終末細胞,這種能力為進行靶細胞、靶器官特異性毒性評價提供了條件.完善高純度、穩定的人胚胎干細胞定向誘導心肌細胞體系是構建藥物心臟毒性評價模型等心臟疾病相關基礎研究的一個重要思路,也是藥物大規模篩選的理想平臺,能夠實現藥物研發及安全性評價的個性化,提高藥物治療、藥物研發的針對性,避免動物實驗帶來的種屬差異,減少藥物研發費用,縮短研發周期.

本工作初步建立了一個高效、簡便的定向誘導人胚胎干細胞分化為心肌細胞的優化模型,同時建立了一種綜合全面的鑒定方案,為細胞模型建立提供了系統的評價方法,為體外心臟毒性評價方法的發展提供了方向,為今后將大量純化人胚胎干細胞來源的心肌細胞用于心臟疾病的科學研究打下了扎實基礎.

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本文彩色版可登陸本刊網站查詢：http：//www.journal.shu.edu.cn

Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes model establishment and systemic identification scheme

CHEN Xinxin,LIU Zhuyuan,GU Huanyu,ZHOU Lei
(Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China)

Cardiomyocytes is useful in the study of many cardiovascular diseases,while human cardiomyocytes are difficult to obtain and culture.With multi-directional differentiation properties,human embryonic stem cells can provide cell resources in vitro.This study aims to establish a useful protocol to induce the differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes,and observe identification of human cardiomyocytes. Expression of stem cell markers including Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2 and Nanog decrease during differentiation while cardiac progenitor cell marker Nkx2.5 andcardiomyocytes specific markers TnnT2 and α-actinin increase.Ratios of TnnT2 positive cells,α-actinin positive cells,TnnT2 and α-actinin double positive cells are 90.80%,91.00%, and 90.91%.These results indicate that human embryonic stem cells can be efficiently induced into cardiomyocytes in the proposed protocol.In conclusion,differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes has been successfully induced and an identification scheme has been established,and markers have been detected through quantitative PCR and immunofluorescence stainings.The protocol will facilitate better understanding of pathogenesis of cardiovascular diseases and enable better cardiotoxicity drug screening. Key words：human embryonic stem cell;cell differentiation;cardiomyocytes

Q 25

A

1007-2861(2017)03-0378-09

10.12066/j.issn.1007-2861.1939

2017-04-03

國家自然科學基金資助項目(81370280,81570332)

周蕾(1970—),女,教授,主任醫師,博士生導師,博士,研究方向為心力衰竭. E-mail：zhouleinjmu@163.com