泛素特異性蛋白酶19對煙熏誘導慢性阻塞性肺疾病大鼠模型骨骼肌萎縮的作用及機制

劉 乾, 劉 松, 徐衛國, 管思彬, 郭雪君

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院呼吸科, 上海 200092)

泛素特異性蛋白酶19對煙熏誘導慢性阻塞性肺疾病大鼠模型骨骼肌萎縮的作用及機制

劉 乾, 劉 松, 徐衛國, 管思彬, 郭雪君

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院呼吸科, 上海 200092)

目的 通過煙熏制備慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型, 研究泛素特異性蛋白酶-19(USP-19)在COPD相關骨骼肌萎縮中的作用及機制。方法 煙熏誘導大鼠COPD模型，觀察肺及骨骼肌組織的組織形態學變化，利用蛋白質印跡法(Western blotting)及實時定量聚合酶鏈式反應(RT- PCR)觀察骨骼肌細胞內USP-19、肌球蛋白重鏈(MHC)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的表達情況。結果 煙熏建立的大鼠COPD模型, 大鼠肺組織呈肺氣腫改變, 煙熏12周時, 每高倍鏡視野下肌纖維數量增多40%，間接提示骨骼肌發生萎縮; 骨骼肌細胞內MHC表達明顯下調，與煙熏時間呈負相關; 萎縮的骨骼肌細胞內USP-19基因的轉錄和表達均明顯上調, 與煙熏時間呈正相關，與MHC表達呈負相關; 萎縮的骨骼肌細胞內MAPKs通路磷酸化水平明顯增強 (P<0.05)。結論 USP-19基因參與COPD模型鼠骨骼肌萎縮的發生，起負性調節作用，此作用可能通過MAPKs通路實現。

煙熏; 泛素特異性蛋白酶-19(USP-19); 慢性阻塞性肺疾病(COPD); 骨骼肌萎縮;絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)

目前, 全球慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 以下簡稱COPD)的發病率和死亡率正逐年增高, 吸煙是COPD發生的主要危險因素之一。除呼吸系統的癥狀及體征外, 營養不良、體質量下降以及骨骼肌萎縮等被視為較為重要的肺外表現。近年來研究表明, 骨骼肌的消耗與肌蛋白降解加速密切相關，其中由泛素介導的蛋白質降解途徑發揮了重要作用。目前已有研究多集中在泛素連接過程，對于去泛素化的研究還知之甚少。

本實驗采用煙熏制備COPD大鼠模型，對實驗大鼠進行了骨骼肌的病理形態學觀察，同時選取泛素特異性蛋白酶-19(USP-19)作為研究對象，分別檢測煙熏前后股四頭肌組織內USP-19基因的表達。試圖通過動物實驗來探討模型大鼠如何發生骨骼肌萎縮，以及USP-19參與骨骼肌細胞萎縮的發生過程，為今后臨床上USP-19基因用于治療骨骼肌萎縮提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 制備COPD大鼠模型與分組

SPF級15周齡雄性SD大鼠, 平均體質量350 g,購自上海斯萊克實驗動物責任公司[SCXK(滬)2007-0005]，飼養于上海交通大學醫學院附屬新華醫院實驗動物中心[ SYXK(滬)2008-0052]。實驗動物分組：隨機數字方法將實驗動物分為對照組(6只)，煙熏4周模型組(6只)，煙熏8周模型組(6只)和煙熏12周模型組(6只)。使用烤煙型大前門香煙(購自上海煙草集團公司, 焦油量為11 mg), 模型組每日上午在自制有機玻璃箱(容積為240 L, 長寬高分別為80 cm, 60 cm, 50 cm)內被動吸煙。每6只動物一箱，每次同時燃燒6支香煙，每日4次，每次煙熏間隔時間為2 h。連續煙熏4周、8周和12周。對照組動物正常吸入空氣。分別于實驗4周、8周和12周稱量體質量，用腹腔注射質量分數1%戊巴比妥鈉處理動物并取肺組織及股四頭肌(骨骼肌)。

1.2 大鼠營養不良的判斷

COPD模型組大鼠體質量降低大于預計值的10%，可判斷為營養不良。預計值為同等條件下正常對照組同齡大鼠的平均體質量。

1.3 病理組織學分析

將肺組織及股四頭肌于體積分數4%多聚甲醛內固定24 h，石蠟包埋，行HE染色后于光學顯微鏡下觀察。

1.4 大鼠各組織內USP-19基因表達情況

取正常大鼠皮膚、大腦、肺臟、肝臟、心臟、股四頭肌、血管、脾臟, 提取各組織總RNA。

1.5 實時定量聚合酶鏈式反應(RT- PCR)

提取的總RNA經逆轉錄后進行RT- PCR。循環條件如下: 預變性：95℃ 30 s; PCR反應：95℃5 s, 60℃ 34 s，進行40個循環。2-△△Ct法進行相對定量分析, 公式: ΔCt = Cttarget-CtGAPDH; ΔΔCt = Δ Ct (CS) -Δ Ct (CTRL); 基因表達水平= 2-ΔΔCt。引物序列:

GAPDH上游: 5'-AAG GTC GGA GTC AAG GGA TTT-3'

GAPDH下游: 5'-AGA TGA TGA CCC TTT TGG CTC-3'

USP-19上游: 5'-GGC ACA AGA TGA GGA ACG A-3'

USP-19下游: 5'-CAG ATA AAG GAA CGG GTC AA-3'

MHC上游: 5'-GCG GAA AGA AAG GTG GCA AGA-3'

MHC下游: 5'-TGG GAA TGA GGC ATC GGA CAA-3'

MyoG上游: 5'-GCG GAA AGA AAG GTG GCA AGA-3'

MyoG下游: 5'-TGG GAA TGA GGC ATC GGA CAA-3'

1.6 Western blotting

提取細胞總蛋白, 利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進行變性電泳, 轉膜, 一抗孵育過夜后二抗孵育2 h; 用ChemiDoc XRS+ Systems遠紅外成像系統掃描結果, 并通過Image Lab 2.0軟件以GAPDH為內參進行分析, 分別進行三次獨立實驗。

1.7 統計方法

RT- PCR、Western blotting結果進行數據統計, 數值以表示，采用SPSS 13.0軟件進行方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況

建模早期(染毒4周)模型組大鼠在染毒箱中吸煙時比較安靜，驅散大鼠聚堆時，部分大鼠有輕度喘息，停止吸煙約半小時后飲食與活動恢復正常，與正常對照組無明顯區別。繼續煙熏，部分大鼠在吸煙以外的時間出現輕度喘息，活動相對減少, 皮毛黃澀, 行動遲鈍, 攝食、飲水減少。正常對照組大鼠飲食正常, 活動靈敏, 皮毛清潔有光澤。

2.2 COPD大鼠模型肺組織的病理改變

對照組大鼠氣道上皮結構完整，肺泡結構正常(圖1A); 煙熏組大鼠細支氣管狹窄變形，管腔內有炎癥細胞及脫落的上皮細胞; 黏膜下及細支氣管周圍可見以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤; 肺泡壁增厚，有炎癥細胞浸潤，可見纖維細胞增生，部分肺泡壁破裂，相鄰肺泡融合形成肺大泡; 具有慢性細支氣管炎及肺氣腫的病理改變(圖1B)。

圖1 大鼠肺臟組織學形態 (HE×100)Figure 1 Histopathological observation on lung of rat (HE×100)

2.3 大鼠體質量變化

造模前模型組和對照組大鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05)。隨后煙熏組大鼠體質量增長速度下降。煙熏8周時模型組大鼠體質量明顯低于對照組, 但尚未達到營養不良的標準; 煙熏12周時模型組大鼠體質量明顯低于對照組(P<0.01), 且體質量下降已超過預計值的10%, 出現營養不良改變(表1)。

2.4 COPD模型大鼠骨骼肌組織形態變化

大體觀察見對照組大鼠股四頭肌組織飽滿、有光澤、彈性佳, 顯微鏡下見肌纖維排列緊密, 細胞核排列整齊，間質內有少量纖維組織(圖2A)。而煙熏大鼠骨骼肌組織暗澀、綿軟, 顯微鏡下觀察見肌纖維橫截面積較正常對照組減小，間質內纖維組織增多，血管組織增生及部分毛細血管擴張充血(圖2B)。高倍鏡下每個視野煙熏大鼠肌纖維數量(362.0±17.7個)較正常對照組(257.0±15.1個)明顯增多，間接反應出肌纖維發生萎縮。

2.5 大鼠各組織內USP-19基因表達情況

各組織內均有USP-19基因表達，心肌組織骨骼肌組織內表達較高(圖3)。

2.6 大鼠骨骼肌內MHC及USP-19基因表達

與對照組相比, 8周及12周的煙熏大鼠骨骼肌組織內USP-19 mRNA和蛋白表達均有所上調(P<0.05),且與煙熏持續時間呈正相關, 煙熏4周后USP-19表達雖上調, 但與對照組相比差異不明顯; 4周、8周及12周煙熏后大鼠股四頭肌組織內MHC mRNA和蛋白表達均下調(P<0.05), 且與煙熏時間呈負相關與體質量下降呈正相關。提示煙熏引起骨骼肌萎縮是體質量下降、營養不良的原因之一; USP-19蛋白在骨骼肌萎縮過程中可能起到負性調節作用(圖4)。

2.7 COPD大鼠模型骨骼肌內MAPKs活性的變化

總ERK和p38水平未發生明顯改變，煙熏組大鼠骨骼肌組織內磷酸化ERK和p38水平明顯升高, 表明細胞內ERK和p38信號通路被激活(圖5)。

表1 大鼠體質量 g

圖2 大鼠股四頭肌組織學形態 (HE×100)Figure 2 Histopathological features of rats quadriceps femoris (HE×100)

圖3 USP-19在組織內的表達Figure 3 USP-19 expression pattern in normal tissues

圖4 大鼠骨骼肌組織內MHC和USP-19基因的表達變化Figure 4 MHC and USP-19 gene expression levels

圖5 大鼠骨骼肌組織內MAPKs通路表達情況Figure 5 Cigarette smoke affected MAPKs signaling pathways activities in skeletal muscle

3 討論

近年來, COPD的發病率和病死率逐年增加，COPD可引起廣泛的肺外損傷，已知泛素-蛋白酶體系參與骨骼肌萎縮的過程，這一體系是由多種泛素化酶及去泛素化酶構成，目前研究多集中在泛素化過程，對于去泛素化酶的作用及機制還知之甚少[1]。

本文實驗證實，通過12周的煙熏可使大鼠肺組織產生肺氣腫改變, 且8周及12周的煙熏暴露可誘發顯著的體質量減輕及肌肉體積減少。Lee等[2]研究表明, 16周的持續煙熏可導致大鼠肺實質損傷,氣腫形成及體質量減輕，與本文結果相似。實驗顯示，在核酸及蛋白質水平，骨骼肌組織內的MHC發生明顯減少，表明骨骼肌組織發生萎縮，煙熏引起骨骼肌萎縮的因素可能包括缺氧，高碳酸血癥, 營養耗竭, 全身炎癥反應和氧化應激[3]。

骨骼肌細胞內表達多種去泛素化酶，其中部分在骨骼肌內特異性表達[4]。Urso等[5]研究制動48 h后人骨骼肌細胞內基因的表達,表明泛素特異性蛋白酶-6(USP-6)mRNA水平明顯升高; Radom-Aizik等[6]對COPD患者進行12周的耐力訓練后檢測骨骼肌的基因表達，表明泛素特異性蛋白酶-15(USP-15)表達較未參加訓練者明顯升高; Bosch-Comas等[7]研究表明，USP-25表達增強可以抑制肌球蛋白結合蛋白C1的降解，從而影響肌肉的分化和生長。本文作者研究首次表明, 煙熏可刺激萎縮的骨骼肌組織內USP-19基因的表達。USP-19的表達與體質量，MHC水平呈負相關, 且與煙熏暴露時間呈正相關。這些結果提示，USP-19基因為骨骼肌分解代謝中的負性調節因子。Combaret等[8]研究表明，惡性腫瘤及長期使用糖皮質激素可誘導大鼠發生骨骼肌萎縮, 萎縮的骨骼肌細胞內USP-19基因表達明顯上調; Bedard等[9]研究表明，USP-19基因敲除的小鼠在糖皮質激素化過程中，較對照組不易發生骨骼肌萎縮。這些結果與本文結果一致。

本實驗中煙熏12周后，骨骼肌細胞內2條主要的MAPKs信號傳導通路被激活，分別為p38及ERK通路。這與已有的多項研究結果相似。如Lecker等[10]證實USP-14在骨骼肌萎縮過程中起負向調節作用，而這一作用可能通過刺激細胞內ERK磷酸化水平而實現; Lee等[2]也證實氧自由基，腫瘤壞死因子a(TNF-a)所誘導的肌纖維的降解機制與p38 MAPK有關，p38的磷酸化水平升高有利于骨骼肌細胞萎縮和蛋白質降解。Penna等[11]研究證實，惡性腫瘤誘發的惡病質病程中，大鼠的骨骼肌組織發生明顯萎縮，萎縮肌肉內ERK磷酸化水平明顯升高; Koistinen等[12]研究表明，2型糖尿病模型大鼠的萎縮骨骼肌組織內p38MAPK通路磷酸化水平明顯上調。這些證據均提示MAPKs通路參與骨骼肌萎縮的發生。

總之，本研究初步證實USP-19作為一個負性調節基因，參與了COPD大鼠骨骼肌萎縮的過程。欲證實USP-19基因是否通過MAPKs通路參與骨骼肌細胞的降解，需通過體外實驗，利用p38及ERK抑制劑及沉默RNA技術加以論證。本文研究結果將有助于對COPD患者骨骼肌功能障礙/骨骼肌萎縮的發生機制的探索，有助于臨床早期發現并避免其高危因素、預防萎縮的發生。

[1] Wing SS. Deubiquitinases in skeletal muscle atrophy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013, 45(10):2130-2135.

[2] Lee JH, Lee DS, Kim EK,et al. Simvastatin inhibits cigarette smoking-induced emphysema and pulmonaryhypertension in rat lungs[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2005, 172(8):987-993.

[3] Man WD, Kemp P, Moxham J, et al. Skeletal muscle dysfunctionin COPD: Clinical and laboratory observations [J]. Clin Sci (Lond), 2009, 117(8):251-264.

[4] Quesada V, Díaz-Perales A, Gutiérrez-Fernández A, et al. Cloning and analysis of 22 novel human ubiquitin-specific proteases[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004 , 314(1): 54-62.

[5] Urso ML, Scrimgeour AG, Chen YW, et al. Analysis of human skeletal muscle after 48h immobilization reveals alterations in mRNAand protein for extracellular matrix components [J]. J Appl Physiol, 2006, 101(4):1136-1148.

[6] Radom-Aizik S, Kaminski N, Hayek S, et al. Effects of exercise training on quadriceps muscle gene expression in chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Appl Physiol, 2007, 102(5):1976-1984.

[7] Bosch-Comas A, Lindsten K, Gonzalez-Duarte R, et al. The ubiquitin-specific protease USP25 interacts with three sarcomeric proteins[J]. Cell Mol Life Sci, 2006, 63(6):723-734.

[8] Combaret L, Adegoke OA, Bedard N, et al.USP19 is a ubiquitin-specific protease regulated in rat skeletal muscleduringcatabolic states[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005, 288(4):693-700.

[9] Bédard N, Jammoul S, Moore T, et al. Inactivation of the ubiquitin-specific protease 19 deubiquitinating enzyme protects againstmuscle wasting[J]. FASEB J, 2015, 29(9): 3889-3898.

[10] Liu N, Kong T, Chen X, et al. Ubiquitin-specific protease 14 regulates LPS-induced inflammation by increasing ERK1/2 phosphorylation and NF-kB activation[J]. Mol Cell Biochem, 2017. doi: 10.1007/s11010-017-2978-0. [Epub ahead of print]

[11] Penna F, Costamagna D, Fanzani A, et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are preventedby ERK inhibition[J]. PLoS One, 2010, 5:e13640.

[12] Koistinen HA, Chibalin AV, Zierath JR. Aberrant p38 mitogen-activatedprotein kinase signaling in skeletal muscle from Type 2 diabeticpatients[J]. Diabetologia, 2003, 46(10): 1324-1328.

Effect and Mechanism of Ubiquitin-specific Peptidase 19 on Muscle Atrophy of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Induced by Cigarette Smoke Exposure in Rats

LIU Qian, LIU Song, XU Wei-guo, GUAN Si-bin, GUO Xue-jun
(Department of Respiration Medicine,Xinhua Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200092)

ObjectiveTo investigate the effects of ubiquitin-specific peptidase 19 (USP-19) on rats bearing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) induced by cigarette smoke (CS) exposure .MethodsRats exposed to chronic CS was chosen for the study. For histological examination, lungs and quadriceps femoris muscle were stained with hematozylin and eosin. Total RNA and protein were extracted for Real-time PCR and Western blot analysis to assess the MHC, USP-19 and MAPKs gene expression .ResultsTwelve weeks CS exposure produced lung lesions that morphologically resembled human emphysema, leading to the enlargement of alveolar ducts. Skeletal cell numbers per high-power (HP) lens increased after 12 weeks by 40% in comparison with the control group, suggesting muscle wasting. Chronic CS exposure decreased the mRNA level of MHC. MHC protein content in the quadriceps femoris muscle was decreased in the 8- and 12-week groups. CS significantly stimulated phosphorylation of ERK1/2, p38 without altering the total ERK1/2, p38 content .ConclusionsCigarette smoke-induced skeletal muscle atrophy is associated with up-regulation of USP-19, which via MAPKs probably.

Cigarette smoke exposure; Ubiquitin-specific peptidase 19 (USP-19); Chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Muscle atrophy; Mitogen-activated protein kinases (MAPKs)

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0185-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.003

2017-03-20

上海市衛生局青年科研項目(編號: 20134Y015)和國家青年科學基金項目(81400026)

劉 乾(1980-), 女, 醫學博士, 呼吸科主治醫師, 從事呼吸系統疾病研究。

E-mail: liuqian_1980@hotmail.com

郭雪君(1964-), 男, 醫學博士, 呼吸科主任醫師, 從事呼吸系統疾病研究。E-mail: snowgen@126.com