二乙基亞硝胺誘導建立Apc基因突變大鼠與F344大鼠肝癌模型的比較

謝 蓓, 趙 磊, 孫 婧, 張麗娟, 庫本高志, 魏虎來

(1. 蘭州大學基礎醫學院, 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室, 蘭州 730000;

2. 中牧實業股份有限公司蘭州生物藥廠, 蘭州 730046;

3. 京都大學醫學院實驗動物研究所, 日本京都 6068501)

二乙基亞硝胺誘導建立Apc基因突變大鼠與F344大鼠肝癌模型的比較

謝 蓓1, 趙 磊2, 孫 婧1, 張麗娟1, 庫本高志3, 魏虎來1

(1. 蘭州大學基礎醫學院, 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室, 蘭州 730000;

2. 中牧實業股份有限公司蘭州生物藥廠, 蘭州 730046;

3. 京都大學醫學院實驗動物研究所, 日本京都 6068501)

目的 采用二乙基亞硝胺(DEN)在F344大鼠、Kyoto Apc Delta(KAD)大鼠體內誘發制備肝癌模型，并比較其優劣。 方法 KAD大鼠25只，隨機法分組，陰性對照組(5只)給予正常飲水; DEN造模組(20只)前5周飲水中添加40 mg/mL DEN，6～20周給予正常飲水; 定期解剖大鼠，肉眼觀察肝臟病變并取病變組織及癌旁組織制作病理切片。25只F344大鼠采用相同方法進行實驗。結果 F344大鼠和KAD大鼠均可成功誘發肝癌，且肝癌發生病理過程與人類相似。造模16周時KAD大鼠就可見灰白色病灶點，3/4大鼠成瘤，平均病灶數為1.00±0.82 個; 造模20周時，KAD大鼠全部(4/4)成瘤, 病灶數為3.50±1.29 個; 而F344大鼠遲至20周時才可觀察到類似病灶，3/4大鼠成瘤，病灶數為1.25±0.96 個。KAD大鼠的誘導成瘤性顯著高于親代F344大鼠(P<0.05)。結論 與親代F344大鼠相比，抑癌基因Apc突變的KAD大鼠經DEN誘導更易發生肝癌，且該模型具有肝癌誘發時間短、相同誘導時間肝癌發生率高、誘發病灶數多等優點，是化學誘發制備肝癌動物模型的良好模式動物。

KAD大鼠; F344大鼠; 肝癌誘導; 二乙基亞硝胺(DEN)

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發生涉及多因素、多階段包含啟動、促進和癌變的復雜病理過程，發病機制尚未完全闡明。類似肝癌發病特點及過程的動物模型在研究肝癌發病機制中起著重要的作用，建立一種理想的肝癌動物模型，不僅有助于探索肝癌發生發展的分子機制，而且對肝癌的預防、臨床治療肝癌藥物的開發等具有重要意義。目前，肝癌動物模型建立的方法多樣，有自發、誘發、移植、轉基因等[1,2]，其中以誘發性肝癌模型應用最廣。該模型接近于人類肝癌的發病特點和過程，但由于其誘導時間長(需3～5個月甚至1～2年)、動物死亡率高等因素制約其廣泛應用[3]，迫切需要探索開發短時高效誘發肝癌模型的模式動物。二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)誘癌特點是成功率高，對肝臟專一，癌變過程與人類肝癌發生過程十分相似，是迄今應用最廣泛的肝癌誘發化學物之一[4-7]。

Kyoto Apc Delta大鼠，即KAD大鼠，為Kuramoto Takashi實驗室使用F344大鼠經N-乙基-N-亞硝基脲(ethylnitrosourea, ENU)誘發制備的結腸腺瘤樣息肉(adenomatous polyposis coli, Apc)基因S2523位點發生無義突變的基因突變大鼠[8]。KAD大鼠的APC蛋白缺少堿基區(basic domain, BD)、EB1結合區及PDZ區域，但仍保留完整的b-catenin蛋白結合區。雖然，KAD大鼠Apc基因發生了無義突變，編碼的APC蛋白翻譯提前終止，但該大鼠體內并無任何疾病發生；經誘癌物氧化偶氮甲烷(zaoxymethane, AOM)和葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘發后，KAD大鼠能高效快速的誘發結腸癌[8]; 經4-硝基喹啉N-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide, 4-NQO)誘導KAD大鼠易發生舌癌等[9]。

基于KAD大鼠使用不同誘癌劑誘發制備的腫瘤模型具有腫瘤誘發時間短、成功率高等優點，這些腫瘤動物模型對疾病的發生機制[10,11]及抗腫瘤藥物的篩選具有重要意義[12]，且KAD大鼠是否經誘導易于發生肝癌目前尚未見報道。本實驗擬以F344大鼠和KAD大鼠為研究對象，探索使用誘癌劑DEN在兩種大鼠體內短期高效誘發肝癌模型的方法并比較其優劣。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

誘癌劑: 二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)，分子式(C2H5)2NNO，密度: 0.95 g/mL，購自Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司。

1.2 實驗動物

5對SPF級4周齡KAD大鼠由日本京都大學Kuramoto Takashi教授購自日本 SLC Inc.公司并贈送本實驗室。經1～2周隔離檢疫后, 大鼠飼養于蘭州大學醫學實驗動物中心屏障系統設施 [SCXK(甘) 2013-0002]中繁殖傳代, 定期使用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(qRT-PCR)方法檢測KAD大鼠中Apc基因突變是否仍存在。SPF級F344大鼠由蘭州大學醫學實驗中心供給 [SCXK(甘)2013-0002]。實驗時取SPF級5周齡雄性KAD大鼠(體質量90～100 g)和SPF級F344大鼠(體質量110～120 g)各25只，實驗在蘭州大學醫學實驗動物中心屏障系統設施[SYXK(甘)2013-0003]中進行，光照周期明12 h∶12 h暗，自由攝食和飲水。動物實驗方案經蘭州大學實驗動物管理機構審查，符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

1.3 KAD大鼠突變基因的鑒定

取SPF級KAD大鼠和SPF級F344大鼠各3只，體質量200～220 g，剪尾法取大鼠尾部尖端組織。常規方法提取基因組DNA，使用Apc基因引物采用定量RT-PCR方法擴增基因，Apc基因引物序列：上游5'-ATCTGTTCAGGCAGGTGGAT-3'，下游5'-TCACTCGAGGAAGGGATGAG-3'。MnlI內切酶剪切基因擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 KAD大鼠和F344大鼠體內肝癌模型的制備

雄性KAD大鼠25只，采用隨機法分組，1組(5只)為陰性對照組，給予正常飲水，飼養20周;另一組(20只)為DEN造模組，前5周飲水中添加40 mg/mL DEN，5周后給予正常飲水，繼續飼養15周至共20周; 期間分別于4、8、12、16及20周分批次分別處死陰性對照組KAD大鼠1只，DEN造模組大鼠4只(隨機選擇)。雄性F344大鼠25只，使用與KAD大鼠相同的分組及造模方法處理。實驗動物乙醚麻醉、頸椎脫臼處死后迅速開腹，肉眼觀察肝臟是否發生病變后完整摘取肝臟組織，稱其重量；切取部分腫瘤組織和癌旁組織分別放入體積分數10%中性甲醛溶液中進行固定，其余組織放入-80 ℃冰箱中備用。

1.5 實驗動物整體觀察

每日隨時觀察動物的精神、毛色、飲食、糞便及活動情況并進行記錄。動物處死后，立即進行解剖學檢查，稱體質量、肝臟重量，觀察肝臟大小、色澤、質地及有無腫瘤結節形成，無癌灶者取肝組織，出現癌灶者取癌結節及距癌灶邊緣0.5～1 cm癌旁組織。

1.6 病理組織學顯微結構觀察

對所取組織常規行體積分數10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片, 蘇木精-伊紅(HE)染色后進行病理組織學檢查, 光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統計學分析

應用SPSS16.0 軟件對數據進行統計分析，實驗數據以表示，組間分析比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KAD大鼠突變基因鑒定

F344大鼠和KAD大鼠剪取鼠尾，分別提取DNA，經RT-PCR擴增和內切酶剪切后，產物由瓊脂糖凝膠電泳檢測KAD大鼠Apc基因突變狀況。結果顯示: KAD大鼠因Apc基因發生突變，基因中MnlI酶切位點消失、基因擴增產物不能被剪切；F344大鼠Apc基因未發生突變，MnlI酶切位點仍存在，經MnlI內切酶作用后Apc基因片段被剪切發生斷裂(圖1)，檢測結果證實KAD大鼠中Apc基因突變并穩定遺傳。

圖1 KAD大鼠Apc基因突變鑒定Figure 1 Authentication results of Apc gene in F344 rats and KAD rats

2.2 大鼠一般狀況觀察

KAD大鼠和F344大鼠在誘癌過程中精神狀態均良好，活動自如，毛色光亮，排糞排便自如，糞便形態良好，無稀釋樣，亦不干燥。大鼠在整個肝癌誘發過程中攝食、飲水自由，至造模結束攝食量變化如表1所示: 因KAD大鼠前期體型偏小,攝食量偏少(P<0.01), 后期體質量增至200～300 g時,各時間段攝食量無明顯差異; 因F344大鼠對誘癌劑比較敏感, 造模組攝食量明顯少于對照組(P<0.05或P<0.01); 而KAD大鼠對誘癌劑敏感性較弱，造模組KAD大鼠攝食量與對照組相比無明顯差異。飲水量變化見表2: KAD大鼠和F344大鼠DEN造模組飲水量與陰性對照組相比均無明顯差異，只是隨大鼠體質量增長飲水量增加。至造模結束無任何動物意外死亡，大鼠存活率均為100%。肝癌誘發過程中，大鼠體質量增長變化如表3所示，隨造模時間延長，KAD大鼠和F344大鼠造模組及陰性對照組體質量均增長; 因F344大鼠對DEN比較敏感，造模初期體質量增長緩慢(P<0.05)，后期兩種大鼠的造模組與對照組相比體質量增長均無明顯差異; KAD大鼠的體質量增長慢于同期F344大鼠。

2.3 KAD大鼠和F344大鼠誘發肝癌比較

定期選取大鼠，乙醚麻醉、頸椎脫臼處死后開腹, 觀察肝臟的表觀變化，結果如圖2所示: 陰性對照組KAD大鼠和F344大鼠肝臟均顏色鮮紅, 表面光滑，色澤明亮均一; 造模組前期，F344大鼠和KAD大鼠肝臟表觀亦正常; 造模后期，F344大鼠和KAD大鼠肝臟均經歷略失光澤－肝臟偏黃－色澤不均一不光亮－灰白色病灶出現等過程。造模16周時KAD大鼠肝臟實質中就已可見單發、圓形、邊界清晰的灰白色病灶點, 體積較小。3/4大鼠成瘤, 平均病灶數為1.00±0.82個; 造模20周時, KAD大鼠全部(4/4)成瘤, 病灶數為3.50 ± 1.29個,且病灶體積明顯增大，肝臟邊緣部分亦可見病灶出現。而F344大鼠遲至20周時才可觀察到類似病灶, 3/4大鼠成瘤, 病灶數為1.25 ± 0.96個。KAD大鼠的誘導成瘤性顯著高于親代F344大鼠(P<0.05)。上述實驗結果初步提示抑癌基因Apc突變的KAD大鼠更易經DEN誘導發生肝細胞肝癌, 且具有誘發時間短、相同誘導時間成瘤率高、成瘤病灶明顯且數目多等優點。整個造模過程中, 取樣時未見KAD大鼠和F344大鼠的肝臟／體質量比有明顯差異(表4)。

表1 F344和KAD大鼠在DEN誘發肝癌過程中攝食量變化Table 1 The food intake of F344 and KAD rats during DEN inducing hepatocarcinoma g

表2 F344和KAD大鼠在DEN誘發肝癌過程中飲水量變化Table 2 The water intake of F344 and KAD rats during DEN inducing hepatocarcinoma mL

表3 F344和KAD大鼠在DEN誘發肝癌過程中體質量增長變化Table 3 The body weight gains of F344 and KAD rats during DEN inducing hepatocarcinoma g

圖2 DEN誘發肝癌形成時F344大鼠和KAD大鼠肝臟的表觀變化Figure 2 The appearance of livers in F344 and KAD rats when the hepatocarcinomas were induced

HE染色光學顯微鏡觀察結果顯示: 陰性對照組KAD大鼠和F344大鼠細胞排列均比較整齊, 核/質比較接近; 造模組KAD大鼠和F344大鼠均經歷脂肪樣變性、脂肪變性空泡化、淋巴細胞侵潤、嗜酸性小體出現、明顯的癌變等過程。造模8周時，KAD大鼠脂肪細胞空泡化明顯，細胞形態發生了明顯的變化, 可見核/質比明顯升高, 核異質明顯，細胞形態不規則，排列比較松散; 造模12周時，出現明顯的淋巴細胞侵潤; 造模16周時，出現嗜酸性小體; 造模20周，則可觀察到明顯的癌變(圖3)。F344大鼠造模8～12周時, 脂肪變性加劇; 造模16周,可見淋巴細胞侵潤; 造模20周，可觀察到嗜酸性小體出現，部分區域可見小的癌變病灶(圖3)。

表4 DEN誘導KAD和F344大鼠肝癌過程中肝臟系數變化Table 4 The liver coefficient in F344 and KAD rats during the hepatocarcinoma formation %

圖3 HE染色檢測DEN誘導肝癌過程中F344和KAD大鼠肝臟組織病理變化Figure 3 Monitoring of the pathological changes by HE in F344 and KAD rats

3 討論

肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，肝癌的發生是一個多步驟多因素參與的復雜過程，迄今為止，有關肝癌發生和發展的生物學機制尚未完全闡明[2,13,14]。能真實反映人類疾病且類似人類疾病狀態的大鼠、小鼠等肝癌動物模型已經成功建立, 為肝癌發生、發展的機制研究提供了有力的工具, 同時, 為藥物篩選及臨床治療方法的臨床前測試提供了良好的動物模型[2]。肝癌動物模型建立的方法多式多樣, 主要有自發性肝癌動物模型、化學誘導動物模型、轉基因動物模型、異種移植性動物模型等[1,2]; 每種方法都有其優點及缺點; 能忠實反映或者至少部分反映肝癌發生發展機制的動物模型的建立仍具挑戰性[14]。化學誘導肝癌動物模型的建立歷經啟動、促進、演進和癌變的復雜過程, 與人類肝癌發生相似, 都經過肝損傷－纖維化－惡性化過程而大受青睞[1,15]。系列抗氧化劑和植物化學物等各類化合物已經作為致癌物在嚙齒類動物中誘發肝癌形成; 如DEN、二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine, DMN)、硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)、四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)、2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene, AAF)、N-亞硝基嗎啉(N-nirosomorpholine, NMOR)、黃曲霉毒素(aflatoxin)等, 它們可通過攝食、飲水、灌胃、呼吸、腹腔注射、皮下注射等方式在嚙齒類動物中誘發肝癌[2,14]。DEN誘發肝癌動物模型的發病過程不僅與人類肝癌發生過程相似，且操作比較簡單、誘癌成功率較高，在肝癌及肝硬化癌前病變等研究中廣泛使用[4,6,7]。DEN的致癌能力在于其可烷基化DNA結構, 引起DNA損傷及細胞變性和在肝細胞中通過激活細胞色素P450形成活性氧而發生誘癌功能[16]，主要局限性在于需要長期注射，一般建立肝癌模型的時間需50周。本實驗使用5周齡雄性大鼠，飲水中加入40 mg/mL DEN, 僅誘導5周, KAD大鼠在16周即可觀察到腫瘤結節形成，而F344大鼠16周時無病灶形成; 至造模結束20周時, 平均每只KAD大鼠誘發肝癌病灶數為3.50 ± 1.29個, 平均每只F344大鼠誘發病灶數僅為1.25 ± 0.96個, 兩者間差異顯著(P<0.05), 且兩種大鼠死亡率均為0。KAD大鼠與F344大鼠相比, 不僅誘癌時間縮短、大鼠存活率100%、相同誘導時間肝癌發生率高、誘發病灶數多, 且在肝癌誘發過程中先后出現了肝細胞損傷－淋巴細胞浸潤－嗜酸性小體出現－癌變的過程，是化學誘導建立肝癌動物模型的理想模型動物。

Wnt/b-catenin信號通路在肝癌發生過程中會異常激活，是人類肝癌發生的主要途徑之一, 但是肝癌發生過程中此信號通路的作用仍未完全闡明[17]。已發現編碼Wnt信號通路成分的多種基因在肝癌中發生突變：如b-catenin(19%～44%)，AXIN1 and AXIN2 (5%～14% and 3%～10%)[18-20]; 此外，免疫組織化學研究結果顯示17～40%人肝癌中出現異常的b-catenin細胞質和細胞核的大量聚集[20]。80%的結腸癌中報道有Apc基因的體細胞突變和5q21 Apc位點雜合性丟失, 而肝細胞癌中尚無類似報道[17]。Colnot等[17]構建一種突變的小鼠模型Apclox/lox，即在Apc基因的14號外顯子中插入loxP序列，發現肝細胞中b-catenin大量聚集，同時肝組織中因b-catenin靶向基因活化而活化b-catenin信號通路。相反，如在肝癌細胞中過表達Apc基因，則會對肝癌生長起抑制作用[21]。體細胞Apc基因的敲除可為人類肝癌研究提供一種極有價值的模型，對肝癌發生的研究非常必要[17]。本實驗使用的KAD大鼠為Apc基因無義突變的大鼠，編碼的APC蛋白翻譯提前終止，但KAD大鼠體內無任何疾病發生; 經

DEN誘導后，Apc基因突變可促進肝癌發生、加快DEN誘導的肝癌發生進程，但具體機制有待進一步研究。

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Comparison on Hepatocarcinoma Model Induced by Diethylnitrosamine in Apc-mutant Rat and F344 Rat

XIE Bei1, ZHAO Lei2, SUN Jing1, ZHANG Li-juan1, KURAMOTO Takashi3, WEI Hu-lai1
(1. Key Laboratory of Preclinical Study for New Drugs of Gansu Province, School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;
2. CAHIC Lanzhou Biological Pharmaceutical Factory, Lanzhou 730046, China;
3. Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Kyoto 6068501, Japan)

ObjectiveTo establish hepatocarcinoma models induced by diethylnitrosamine (DEN) in F344 rats, KAD (Kyoto Apc Delta) rats and compare the advantages and disadvantages between them .MethodsTwenty-five KAD rats were randomly divided into 2 groups. The 5 rats in control group were given the normal water. The 20 rats in experimental group were given the water containing 40 mg/mL DEN for 5 weeks, and the remaining 15 weeks they were given the normal water. Every 4 weeks, part of KAD rats was sacrificed to undergo pathological examination and make pathological sections of liver tissues and tumor tissues. Twenty-five F344 rats were treated the same as KAD rats .ResultsHepatocarcinoma could be induced successfully in KAD rats and F344 rats. The same pathological developing process was found in them, which was similar with human. The average of 1.00±0.82 grey-white lesions could be found in 3 KAD rats (3/4) when they were induced in the 16th week, while no lesions could be found in F344 rats (0/4) at that time. Until the end of the experiments (20 weeks), 3.50 ±1.29 cancers and gray-white lesions had been developed in KAD rats, while only 1.25±0.96 could be found in F344 rats. The success rate of hepatocarcinoma induction in KAD rats was better than that in F344 rats significantly (P<0.05) .ConclusionComparing to F344 rats, KAD rats could be a better hepatocarcinoma induction model, with shorter induction time, higher sucess rate and numbers of hepatocarcinoma. KAD rat may be an ideal model for dynamically researching the hepatocarcinoma induction.

KAD rat; F344 rat; Hepatocarcinoma induction; Diethylnitrosamine (DEN)

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0191-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.004

2017-01-05

甘肅省自然科學研究基金計劃項目(1208RJZA190)

謝 蓓(1980-), 女, 講師, 博士, 研究方向: 腫瘤分子生物學。E-mail: xieb@lzu.edu.cn

趙 磊(1980-), 共同第一作者, 男, 獸醫師, 研究方向: 動物醫學。E-mail: leilei8071@hotmail.com

魏虎來(1962-), 男, 教授, 研究方向: 腫瘤分子生物學。E-mail: weihulai@lzu.edu.cn